胶原在肿瘤肿瘤转移中的作用

胶原在肿瘤肿瘤转移中的作用

肿瘤转移是肿瘤细胞向核电站肿瘤以外的生长过程，也是肿瘤死亡的主要原因之一。因此,阐明肿瘤转移机制并如何阻断转移过程具有重要意义。肿瘤的侵袭与转移必须要求两个条件:肿瘤血管生成及破坏细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)。在众多影响肿瘤侵袭和转移的因素中,ECM是阻止肿瘤转移的第一道屏障,在肿瘤浸润转移过程中,肿瘤细胞与周围的外基质之间发生一系列的动态变化。1般蛋白聚糖protegrange,pgECM是由四大家族构成:(1)胶原蛋白(collagen);(2)蛋白聚糖(proteoglycan,PG);(3)弹性蛋白(elastin);(4)细胞外基质糖蛋白。1.1不同类型的胶原的分离纯化胶原蛋白是ECM的主要组成成分,是由从遗传学到分子结构都不同的一组蛋白质组成的大家族,分布于几乎一切组织中。归属到胶原家族的蛋白质具有自然状态结构完整性的功能。根据外显子结构分析结果,将胶原分为五组:(1)纤维性胶原,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ型胶原,这些胶原可以在许多组织中形成高度缠绕的纤维;(2)FACIT胶原,包括Ⅸ、Ⅻ、Ⅹ、Ⅳ型胶原,这组胶原的分子往往与纤维性胶原形成的纤维有关;(3)短链胶原,由Ⅷ和Ⅹ型胶原组成,这两种胶原分子都很小,但分布不同,Ⅹ型胶原存在于肥大软骨中,而Ⅷ型胶原却广泛存在于心脏、肝脏、肾脏和肺等组织中;(4)基膜胶原,为Ⅳ型胶原,是基膜的主要组成成分,与基膜的其它成分层粘连蛋白(laminin)、巢蛋白(nidogen)和硫酸肝素蛋白聚糖共同构成基膜的网状结构;(5)其它胶原,包括Ⅵ、Ⅶ及ⅩⅢ型胶原。1.2人体中三种gagPG是一种无处不在的蛋白家族,存在于细胞表面、细胞内囊泡、或与ECM结合。PG分子上的糖链为糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG),人体中存在七种GAG:透明质酸(hyaluronicacid)、硫酸软骨素A(chondroitinsulfateA)、硫酸软骨素C(chondroitinsulfateC)、硫酸皮肤素(dermatansulfate,DS)或硫酸软骨素B(chondroitinsulfateB)、硫酸角质(keratansulfate,KS)、肝素(heparin,HP)及硫酸肝素(heparansulfate,HS)。1.3氧化酶的添加弹性纤维结构复杂,由弹性蛋白、纤维状蛋白质和赖氨酰氧化酶组成,甚至还含有一定量的蛋白聚糖。弹性蛋白具有独特的氨基酸组成,酸性和碱性氨基酸含量低,缬氨酸含量高,甘氨酸和脯氨酸各占氨基酸总量的1/3和1/8。1.4维持基膜的相关蛋白及活性化合物ECM糖蛋白是ECM四大家族中发展最为迅速的家族,包括非胶原蛋白在内的诸种ECM糖蛋白。目前已发现的有十余种,为层粘连蛋白(laminin,LN)、纤连蛋白(fibronectin,FN)、Jt蛋白、巢蛋白(nidogen)、osteopontin、聚集蛋白(agrin)、黏蛋白(mucin)、restrictin、osteonectin、生腱蛋白(tenascin)、thrombospondin等。LN及其相关蛋白对维持基膜的正常功能起重要作用,参与细胞吸附、迁移、生长和分化。FN分子上的不同部位可以与胶原、肝素、硫酸肝素及细胞血纤蛋白结合,这种结合是FN活跃生物功能的分子基础。FN可以增进细胞黏着、影响细胞迁移及分化、参与细胞骨架构建及细胞形态的形成。osteopontin(OPN)存在于乳汁、骨骼、肾、子宫及蜕膜中,OPN通过RGD序列依赖性和非RGD序列依赖性途径与细胞和ECM相互作用,与肿瘤转移的密切关系日益受到重视。2肿瘤细胞的黏附及降解Liotta提出的肿瘤细胞浸润转移的三步骤假说仍被广为接受。该过程从分子水平上可以分为3个阶段:肿瘤细胞之间的解黏附和肿瘤细胞与ECM之间的黏附;ECM的降解:肿瘤细胞和宿主细胞分泌的蛋白水解酶,使肿瘤细胞周围的ECM发生降解;运动:肿瘤细胞被生长因子及趋化因子诱导,向纵深运动。此过程反复连续进行,宏观结果即表现为肿瘤细胞向外扩展、侵袭。3肿瘤转移、细胞外基质和基底膜3.1蛋白家族和跨膜蛋白质家族的基因组织转移过程中首先是细胞黏着特性的改变,细胞间黏着分子改变了肿瘤细胞和ECM以及间质细胞之间的结合。涉及到肿瘤细胞转移的细胞黏着分子(celladhesionmolecule,CAM)根据化学结构和功能特征分属于以下几个基因家族:钙黏着蛋白家族(cadherins)、整联蛋白(integrins)家族、免疫球蛋白大家族(immunoglobulinsuperfamily)、选择蛋白家族和透明质酸受体家族。所有这些均为跨膜蛋白质。钙黏着蛋白由多个家族成员组成,根据组织分布的不同分为E、P、N、V、M等多种亚型,利用其胞外结构序列来识别和介导同种细胞间的黏着反应。整联蛋白及其家族在人体各组织中表达,它介导细胞与细胞、细胞与基质之间的反应,参与细胞信号传递、细胞黏着、迁移,控制细胞分化、增殖以及凋亡等各种生理过程。免疫球蛋白大家族的CAM介导非离子依赖的同嗜性和异嗜性相互作用,同时也是整联蛋白及ECM蛋白的受体。透明质酸受体是一种多功能的细胞表面跨膜蛋白质,主要与ECM中的透明质酸结合,也能与胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等结合,参与细胞和基质的黏着。3.2ecm及细胞间黏着蛋白的酶对肿瘤微环境的研究表明,它们也参与了肿瘤的侵袭和转移,而以往研究往往将焦点集中于肿瘤细胞本身的特性上,忽略了微环境的影响。肿瘤周围微环境包括纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞及ECM。肿瘤细胞降解基质蛋白是局部侵袭和转移的必需步骤,而降解的基质蛋白对肿瘤细胞的生长增殖有帮助。降解ECM和细胞之间黏着蛋白的酶主要有以下几种:基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP);组织丝氨酸蛋白水解酶,包括尿激酶型纤溶酶原激活系统(urokinase-typeplasminogenactivatorsystem,u-PA)、纤溶酶、凝血酶等;ADAM(adamalysin-relatedmembraneproteases)家族分子;骨形态发生蛋白1型金属蛋白酶(BMP-1-typemetalloproteinase);乙酰肝素酶(heparanase);组织蛋白酶(cathepsin)。以下分述研究较多的与ECM相关的肿瘤转移因素。3.2.1mmp治疗肿瘤细胞级在肿瘤侵袭过程中,肿瘤细胞首先与基底膜表面受体如纤连蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)结合,然后分泌MMP等降解酶或诱导基质细胞分泌酶类,降解基底膜和基质,最终肿瘤细胞沿基底膜缺损和基质空隙向周围生长。MMP主要以3种机制促进肿瘤细胞的侵袭生长:(1)蛋白酶作用使得肿瘤细胞周围由基质分子如胶原、LN、FN等形成的物理屏障被破坏;(2)MMP可以重塑细胞间黏附力,以便肿瘤细胞向周围生长;(3)MMP作用于基质成分后,激发其他一些潜在的生物活动,如MMP-2分解LN-5后可产生具催化作用的可溶性片段,参与肿瘤的免疫过程。因此,MMP活性上调与肿瘤侵袭、转移有关。3.2.2纤溶酶原pa已经证明在许多肿瘤中,u-PA和它的调节系统参与了肿瘤的转移。u-PA主要通过结合位于细胞表面的u-PA受体发挥作用,两者结合后,u-PA能够水解剪切无活性的丝氨酸纤溶酶原,将其转变成有活性的纤溶酶,纤溶酶能降解ECM蛋白,包括纤连蛋白、透明玻连蛋白(vitronectin),层粘连蛋白、纤维蛋白、纤溶酶原激活胶原酶前体。u-PA和纤溶酶还能激活许多生长因子前体分子,包括SF/HGF、bFGF、TGF-等。u-PA的活性受纤溶酶原激活抑制剂PAI-1、PAI-2的调控。在许多肿瘤,包括肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌和前列腺癌中都有u-PA及相应调节分子的高表达,并且与肿瘤的预后、复发、转移密切相关。3.2.3促进血管生成硫酸乙酰肝素聚糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)是在机体中广泛存在的生物大分子,在维持组织的屏障、维持ECM及许多生物分子稳定性中发挥作用。它也是许多生物分子与细胞表面以及ECM结合的桥梁。乙酰肝素酶对硫酸乙酰肝素的剪切影响了组织的完整性和功能,导致肿瘤细胞在变化的微环境中发生迁移。乙酰肝素酶是哺乳动物中发现的第一个能降解硫酸乙酰肝素分子的酶,主要表达于肿瘤细胞和肿瘤病灶中,并且与许多肿瘤的转移表型密切相关,这些肿瘤包括前列腺癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等。乙酰肝素酶的另一个功能是促进血管生成因子释放进ECM,加速肿瘤内血管的生成。无转移能力的细胞株转化乙酰肝素酶后能获得转移能力,而抑制乙酰肝素酶的活性就能减少实验动物发生肿瘤转移的概率。有文献报道通过的基因转染实验获得了HPA促进肿瘤转移最直接的证据。他们通过载体将HPA分别导入无转移潜力的小鼠淋巴瘤细胞系和低转移潜力的黑素瘤细胞系,结果转染细胞均有高水平HPA表达,并获得高转移潜能,经裸鼠静脉接种后大体标本和显微镜检均发现转染组有明显肝转移灶。陈晓鹏等用含人全长乙酰肝素酶cDNA的pcDNA3-HPA质粒转染人肝癌细胞株,用侵袭小室观察肝癌细胞穿膜细胞数。证明普通无侵袭转移潜能的肝癌细胞经转染HPAcDNA后可以获得较高侵袭转移能力,同时也证明了HPA具有促进肿瘤侵袭转移的特性。王顺祥等设计合成互补于HpAmRNA起始密码区的反义寡核苷酸(AS-ODN),以阳离子脂质体oligofectamineTMreagent包埋后转染BEL-7402细胞。以基底膜重建实验检测细胞侵袭力的变化。结果显示一定浓度的HPAAS-ODN可通过下调HPAmRNA和蛋白的表达抑制肝癌细胞的侵袭力。Chen等将无义寡核苷酸(N-ODN)和5条相对于HPAmRNA不同部位的AS-ODN转入食管癌EC9706细胞,结果表明AS-ODN可以抑制HPAmRNA的表达,AS-ODN和N-ODN间有显著的差异,而AS-ODN间差异不明显,从而指出AS-ODN能显著抑制食管癌的侵袭转移。Ogishima等用EGR1siRNA转染T24膀胱癌细胞株后相对于对照组siRNA转染明显下调HPA表达。Yang等也证实,反义介导的HPA活性抑制能显著降低结肠癌LS-174T细胞的侵袭能力。3.2.4肿瘤细胞前转移临床研究较多的是组织蛋白酶B,近年的体外实验发现组织蛋白酶B可以降解纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白等ECM成分,而且诸多实验证实组织蛋白酶分布在肿瘤细胞外围,且可以激活能够降解ECM的尿激酶型纤溶酶原激活物、MMP等。因此认为组织蛋白酶B在肿瘤细胞向深部组织浸润和远处转移的过程中起重要作用。利用原位杂交技术、蛋白质印迹法及免疫组化等技术研究发现,胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、甲状腺癌等多种恶性肿瘤组织中,组织蛋白酶B的表达及其活性均成倍甚至3-9倍高于邻近正常组织,并且在结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞中发现,组织蛋白酶B过表达在肿瘤侵袭边缘最为显著,细胞周围基质染色明显,且组织蛋白酶的表达水平与肿瘤的大小及淋巴结转移相关。这些现象均提示组织蛋白酶可能与肿瘤侵袭有关。另外,肿瘤血管内皮细胞产生蛋白水解酶,在肿瘤血管生成过程中起重要作用。现认为,肿瘤间质内毛细血管及成纤维细胞分泌组织蛋白酶,可降解血管基底膜和ECM,有利于血管内皮细胞的迁移,从而促进肿瘤新生血管的形成,血管生成的增加和组织蛋白酶B的过表达明显相关,血管密度较高与区域性淋巴结转移有关。4新血管生成药物侵袭和转移虽然是恶性肿瘤最基本的特征,但脉管系统在肿瘤的生长和转移方面有着重要的作用。在没有新血管生成以前,肿瘤只生长到1-2mm3,不会发生转移;而在新血管生成后肿瘤成数倍增长,转移机会随之增高。而近年来也有大量的实验研究表明,淋巴管生成在肿瘤淋巴结转移过程中起着不容忽视的作用。所以联合研究肿瘤的血管生成和淋巴管生成在肿瘤的防治中有重要意义。4.1血管生成机制肿瘤血管生成是指从已存在的血管床中产生出新生血管系统,包括血管内皮细胞增殖、继续增殖提供充足的氧气和营养物质,受控于多种血管生成因子。正常的血管生成被严格控制于某些暂定的、特定的生理过程,如生殖过程、发育过程和伤口愈合过程,而持续的血管生成是某些病理改变如肿瘤生长的特性。事实上,血管生成不但是肿瘤生长所必需的,而且肿瘤细胞与新生血管系统的接触还是导致远处转移的原因。肿瘤血管生成是一个连续的过程,其主要步骤如下:肿瘤血管内皮细胞释放出多种血管生成因子;血管内皮细胞(EC)因血管生成因子的作用而出现形态改变,包括各种细胞器数目和大小的增加以及伪足的出现;EC和肿瘤细胞释放蛋白酶以降解毛细血管基底膜和周围ECM,继而引起ECM重塑;EC从毛细血管后微静脉迁徙出来形成血管新芽;EC增殖;肿瘤微血管分化和成型。4.2淋巴管更新的基础淋巴管作为血管系统的补充,形成了一个循环网络系统;淋巴管网由树样结构的脉管构成,它收集组织液、代谢产物、从毛细血管中漏出的大分子以及细胞成分,并将其转运回血液循环。淋巴管不但起着维持正常组织液的平衡和机体的免疫监视作用,而且为许多恶性肿瘤提供了转移的通道。临床病理学证实,实体肿瘤最早是通过淋巴管通路播散至局部淋巴结的。淋巴管的生成是指新的淋巴管的形成。目前已知许多疾病的关键病理进程均涉及到淋巴管生成,尤其是恶性肿瘤的播散过程。近年来,随着促淋巴管生成因子如血管内皮生长因子-C(vascularendothelialgrowthfactor-C,VEGF-C),VEGF-D和淋巴管内皮细胞特异性标志如血管内皮生长因子受体-3(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-3,VEGFR-3)、淋巴管透明质酸酶受体-1和Prox-1等的相继发现,以及在动物实验和临床病理研究中广泛应用,淋巴管生成因子在肿瘤淋巴管生成和肿瘤转移中作用