第二章 基因工程操作常规技术2(方)

聚合酶链式反应（polymerase

chain

reaction,

PCR）•

PCR是模拟体内DNA复制

条件，应用DNA聚合酶反

应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。Kary

B.

Mullis2.1.4

基因扩增技术PCR技术简史•DNA的复制••核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’

3’解旋酶解链酶

5’DNA解旋解链合成引物子链延长5引物酶PCR技术简史•DNA的复制••核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长AUCGCGTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGGGAUCG

引物酶

5‘

RNA引物RNA引物TAGCGCTATCGCATCGACGCT

GGAUCGAUCGCGPCR技术简史•DNA的复制••核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明

DNA解旋解链合成引物子链延长3’5‘

5‘3’5’3’

3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC

TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

ATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史

•

DNA的复制•

核酸体外扩增的设想•

聚合酶链反应的发明•

1971年，Khorana提出：经过DNA

变性，与合适引物杂交，用DNA聚

合酶延伸引物，并不断重复该过程

便可克隆基因。•

但由于测序和引物合成的困难，以

及70年代基因工程技术的发明使克

隆基因成为可能，所以，Khorana

的设想被人们遗忘了……PCR技术简史•

DNA的复制

•

核酸体外扩增的设想

•

聚合酶链反应的发明•

1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明

了聚合酶链反应（PCR）•

基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制•

最初采用E-coli

DNA聚合酶进行PCR，由于该

酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错•

耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进

行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动

化热循环仪•

1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖Kary

B.

Mullis<<The

Unusual

Origin

ofthe

Polymerase

Chain

Reaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR

为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA……PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。PCR仪器的变迁三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）电加热块＋自来水冷却（PE，1988）电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测(如Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）PCR仪721234522时间（min）

94

温

度（℃）

55

1

2

3

高温变性

低温退火

适温延伸重复1-3步25-30轮

目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性形成单链

DNA变性子链延伸

DNA加倍PCR的基本原理94℃模板DNA50℃

引物1

DNA引物引物272℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶94℃

第1轮结束

第2轮开始50℃

•Taq

•

•

Taq

TaqTaq72℃72℃

第2轮结束PCR体系的主要组分和反应条件

标准的PCR反应体系4种dNTP混合物

各200umol/L引物

各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaq

DNA聚合酶

2.5uMg2+

1.5mmol/L1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng

DNA模板/100

L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。(2)引物设计：a.序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。b.引物长度以15-40

bp为宜。c.碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。d.引物内部避免形成二级结构。e.两引物间避免有互补序列。f.引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。引物浓度0.1-0.5

mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermus

aquaticus)0.5-2.5

U/50

l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）

Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；

Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）PCR的条件(1)

变性使双链DNA解链为单链94℃

20-30s(2)

退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75℃，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加Reaction

Condition

for

a

Typical

PCR

AssayTypical

PCR

Thermal

Profile*This

cycle

is

normally

included

in

a

PCR

assay

in

order

toallow

any

“unfinished”

product

from

previous

amplification

toachieve

its

full

length

PCR动画1stcycle2ndcycle3rdcycle过程变性引物退火DNA复制•灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.

能从100万个细胞中检出一个靶细胞••简便、快速

1.一次性加好反应液，2～4

小时完成扩增

2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低

血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的特点PCR的应用•

研究–

基因克隆，DNA测序，分析突变•

诊断–

细菌、病毒、寄生虫检测，诊断•

人类基因组工程–

遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱•

法医–

犯罪现场标本分析•

肿瘤–

各种肿瘤检测•

其他……

1)

基因克隆重组DNA质粒DNA基因片段

2)