高通量测序原理

利用onetouch生成油包水微滴（微球？）和PCR反应，利用RainDropDigitalPCR的sense检测（CCD）（454,SOLID,HISEQ,PACBIO,流式细胞仪，显微镜，单分子的光信号)454直到2005年，454推出了FLX焦磷酸测序平台美吉生物拥有罗氏454公司开发的第二代DNA高通量测序仪GenomeSequencerFLX+（GSFLX+）。GSFLX+的命名正是来源于其在多领域的灵活（flexible）应用。该系统性能的提升和应用领域的不断扩展，对大规模基因序列研究的相关应用领域产生了巨大的推动作用。试剂：GSFLXTitaniumsequencingKitXL+产量：100万序列∕Run读长：最高可达1000bp测序通量每次实验可以产生400～800Mb数据运行时间每次实验只需23h序列读长单条序列的平均读长在600bp以上序列质量单碱基准确率为99%序列产量平均每次实验可以产生100万条的序列应用：基因组denovo测序、转录组denovo测序、宏基因组测序、重测序Illumina1999年，Illumina只是一家拥有25人的初创公司，主要销售微阵列芯片(microarraychip)，这种芯片可用来检测基因组上特定部位的重要变化。2007年，Illumina宣布以6亿美元收购基因测序公司Solexa，从而进军基因测序市场。Solexa的基因测试技术较竞争对手快百倍，且价格低廉。2013年收购了无创产前诊断公司VerinataHealth。自2005年以来，Illumina在并购领域的投资已超过12亿美元。2014年1月，Illumina发布了新款高端基因测序仪，可以准确测出全基因组序列，而成本还不到1000美元。[2]

高通量运行模式*快速运行模式*读长双流动槽（仅适用于HiSeq2500）单流动槽（HiSeq1500或2500）双流动槽运行时间双流动槽（仅适用于HiSeq2500）单流动槽（HiSeq1500或2500）双流动槽运行时间1×3695-105Gb47-52Gb2天18-22Gb9-11Gb7小时2×50270-300Gb135-150Gb5.5天50-60Gb25-30Gb16小时2×100540-600Gb270-300Gb11天100-120Gb50-60Gb27小时2×150N/AN/AN/A150-180Gb75-90Gb40小时通过过滤的读取最多30亿个单端读取或60亿个末端配对读取最多15亿个单端读取或30亿个末端配对读取

最多6亿个单端读取或12亿个末端配对读取最多3亿个单端读取或6亿个末端配对读取

质量在2x50时，≥85%的碱基高于Q30在2x100时，≥80%的碱基高于Q30在2x50时，≥85%的碱基高于Q30在2x100时，≥80%的碱基高于Q30在2x150时，≥75%的碱基高于Q30应用：基因组denovo测序、基因组重测序、转录组测序、小RNA测序、ChIP-Seq测序、甲基化测序平台概况

HiSeq2500：强大的测序仪如今更快更灵活[新品推荐]

HiSeq2000系统绝对是当前最广泛采用的新一代测序主流平台。HiSeq1500/2500系统是这个平台中的最新成员。相同的核心结构，整合最新进展如内置簇生成和快速运行模式，可实现最快的无人值守流程：能够在大约24小时内完成整个基因组的测序，即“一天一个基因组”。今年初，Illumina公司宣布推出HiSeq2500测序系统，能够让研究人员和临床医生能够在大约24小时内完成整个基因组的测序，即“一天一个基因组”。这款仪器的出现，让科学界兴奋不已。经过大半年的等待，HiSeq2500终于面世。同时上市的还有HiSeq1500系统。生物通

HiSeq1500/2500系统是世界上最广泛采用的新一代测序平台中的最新成员。HiSeq1500/2500系统具有与革命性的HiSeq2000系统相同的核心结构，并整合最新进展，如内置簇生成和快速运行模式，实现了最快的无人值守流程。前所未有的灵活性生物通

HiSeq2500系统是Illumina第一台特有两种运行模式的测序系统，包括快速运行和高产量运行模式，可使用一个或两个流动槽，使之成为一个灵活且可扩展的平台。快速运行模式提供快速的结果、数量有限样品的高效处理，以及更长的末端配对150bp读取，这带来了更深度的覆盖，并改善denovo应用的组装。高产量模式特别适合样品量较多的大型研究，或需要最深度覆盖的应用。高产量模式可处理的样品量是快速模式的~5倍，让大型项目可通过尽可能少的运行来完成。HiSeq2500的多个配置让产量可调，既能在7小时内获得~10Gb或~3亿个单端读取，又能在11天内获得600Gb或60亿个末端配对读取，这取决于应用需求或项目期限。高效的样品批处理从未如此简单，而周转时间也从未如此之快。HiSeq1500也具有这两种运行模式，支持单个流动槽，而不是两个。HiSeq1500/2500系统让您的实验室拥有前所未有的灵活性，以便支持最广泛的应用和研究规模。惊人的速度和通量生物通

快速运行模式是HiSeq系统设计上的一个革命性附加，它通过缩短的循环时间和内置的簇生成来显著加快运行。在快速运行模式下，您能够完成全自动的簇生成和测序，在一个工作日内实现短读取应用，或在一天多的时间内通过末端配对100bp读取实现全基因组测序应用。数据通量超过100Gb，因此一天内人类基因组的测序覆盖度超过30倍（图1）。在需要快速且准确的答案时，快速运行时间再加上卓越的数据质量很关键。快速运行模式的加速运行以及平行处理约6亿个测序模板的能力带来了现有测序系统中最高的每日通量。出色的数据质量生物通

高的数据质量是通过行业中最广泛采用的边合成边测序（SBS）技术的应用来确保的。HiSeq1500/2500系统的SBS技术利用专利的可逆终止子方法对数百万个片段进行测序，在单个碱基掺入增长的DNA链时检测它们。由于每个测序循环中四种与可逆终止子结合的dNTP都存在，故自然竞争让掺入偏向最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。最终结果是高度准确的base-by-base测序，几乎避免了序列背景特异的错误，即使是在那些重复序列区和同聚物中。Illumina测序带来了行业中任何覆盖水平的最准确人类基因组、最高产量的无错误读取以及最高比例的>Q30碱基检出（图2）。卓越的数据质量和存储方案生物通

Illumina生物信息学的新发展包括数据压缩改善、测序比对算法更快，以及一套即插即用的数据计算和存储方案。HiSeq1500/2500软件将数据体积缩小50%以上，而不会损害数据质量。这允许产量加倍，而无需将数据存储能力扩大两倍。HiSeq1500/2500软件还能够与BaseSpace®实时连接，这是一种云计算环境，可实现实时的碱基检出、比对后的数据分析以及可扩展的数据存储。将数据上传至BaseSpace可实时进行，通常在运行完成几分钟后结束。BaseSpace中的数据上传、数据比对或变异检出不会产生任何额外的费用。研究人员可通过BaseSpace云端开展合作，与世界上的任何人即时安全地共享数据。生物通

BaseSpace还提供Illumina序列分析和比较软件（iSAAC™）-目前最快的比对软件。iSAAC软件的速度有了4-6倍的提高，可在几小时内将一个30x的基因组与参考基因组比对。比对可在BaseSpace中免费开展，或利用经济的商业化计算硬件开展。iSAAC软件对生物学家而言简单易用，而对生物信息学家而言又足够灵活，可访问并修改开放源代码。BaseSpace应用商店将提供更多的工具和软件，带来商业化、免费软件和用户开发应用的组合。研究人员也可使用IlluminaCompute™，这是一套即插即用的测序数据计算和存储方案。IlluminaCompute特有来自我们的合作伙伴Dell和EMCIsilon的行业领先技术，来自Illumina客户解决方案的安装和维护，以及一套预置的软件，用于数据处理、比对和变异检测。有了IlluminaCompute，实验室可在几周而不是几个月内全面投入运作，甚至无需预先购买IT设备。Illumina公司开发的MiSeq测序仪，它是Illumina公司于2011年2月推出的小型测序平台，是一台内置簇生成和数据产生的测序仪，具有测序速度快，数据准确的优点，可实现300bp×2的测序长度，具备革命性的便捷流程。读长时间总数据量Q301×36~4hrs540-610Mb﹥90%2×150~24hrs4.5-5.1Gb﹥80%2×250~39hrs7.5-8.5Gb﹥75%2×300~65hrs13.2-15Gb﹥70%应用：微生物多样性分析、宏基因组测序、转录组denovo测序、微生物基因组测序、小RNA测序、表达谱、ChIP-Seq性能参数：SolexaSOLiD3运行一次即获得50GBLeroyHood上世纪80年代中期设计了第一台自动荧光测序仪之后，ABI迅速收购了一家测序公司——AgencourtPersonalGenomics，并在2007年底推出了SOLiD新一代测序平台。SOLiD全称为supportedoligoligationdetetion，它的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。就通量而言，SOLiD3系统是革命性的，目前SOLiD3单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。而其无以伦比的准确性、系统可靠性和可扩展性更让它从其他新一代测序平台中脱颖而出。为什么SOLiD能轻松实现貌似不可能的任务？让生物通带你从测序原理入手，一探究竟。

SOLiD工作流程

a.文库制备

SOLiD系统能支持两种测序模板：片段文库(fragmentlibrary)或配对末端文库(mate-pairedlibrary)。使用哪一种文库取决于你的应用及需要的信息。片段文库就是将基因组DNA打断，两头加上接头，制成文库。如果你想要做转录组测序、RNA定量、miRNA探索、重测序、3’,5’-RACE、甲基化分析、ChIP测序等，就可以用它。如果你的应用是全基因组测序、SNP分析、结构重排/拷贝数，则需要用配对末端文库。配对末端文库是将基因组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然后用EcoP15酶切，使中间接头两端各有27bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。

b.乳液PCR/微珠富集在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR（EmulsionPCR）。PCR完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板经过3’修饰，可以与玻片共价结合。看到这里，是不是有一种似曾相识的感觉呢？那就对了，此步骤与454的GSFLX基本相同。不过SOLiD系统的微珠要小得多，只有1um。乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”，基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导的PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反应结束后，P1磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模板扩增产物。

c.微珠沉积

3’修饰的微珠沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。SOLiD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。

d.连接测序这一步可就是SOLiD的独门秘笈了。它的独特之处在于没有采用惯常的聚合酶，而用了连接酶。SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。探针3’端1～5位为随机碱基，可以是ATCG四种碱基中的任何一种碱基，其中第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区，下图的双碱基编码矩阵规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜色的对应关系，而3～5位的“n”表示随机碱基，6～8位的“z”指的是可以和任何碱基配对的特殊碱基。

单向SOLiD测序包括五轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应。第一轮测序的第一次连接反应由连接引物“n”介导，由于每个磁珠只含有均质单链DNA模板，所以这次连接反应掺入一种8碱基荧光探针，SOLiD测序仪记录下探针第1、2位编码区颜色信息，随后的化学处理断裂探针3’端第5、6位碱基间的化学键，并除去6~8位碱基及5’末端荧光基团，暴露探针第5位碱基5’磷酸，为下一次连接反应作准备。因为第一次连接反应使合成链多了5个碱基，所以第二次连接反应得到模板上第6、7位碱基序列的颜色信息，而第三次连接反应得到的是第11、12位碱基序列的颜色信息……几个循环之后，引物重置，开始第二轮的测序。由于第二轮连接引物n-1比第一轮错开一位，所以第二轮得到以0，1位起始的若干碱基对的颜色信息。五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2位...…的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3…”组成的SOLiD原始颜色序列。

e.数据分析

SOLiD测序完成后，获得了由颜色编码组成的SOLiD原始序列。理论上来说，按照“双碱基编码矩阵”，只要知道所测DNA序列中任何一个位置的碱基类型，就可以将SOLiD原始颜色序列“解码”成碱基序列。但由于双碱基编码规则中双碱基与颜色信息的简并特性（一种颜色对应4种碱基对），前面碱基的颜色编码直接影响紧跟其后碱基的解码，所以一个错误颜色编码就会引起“连锁解码错误”，改变错误颜色编码之后的所有碱基。和其它所有测序仪一样，测序错误在所难免，关键是对测序错误的评价和后续处理。由于SOLiD系统采用了双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误，提供内在的校对功能。这样，双保险确保了SOLiD系统原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。为避免“连锁解码错误”的发生，SOLiD数据分析软件不直接将SOLiD原始颜色序列解码成碱基序列，而是依靠reference序列进行后续数据分析。SOLiD序列分析软件首先根据“双碱基编码矩阵”把reference碱基序列转换成颜色编码序列，然后与SOLiD原始颜色序列进行比较，来获得SOLiD原始颜色序列在reference的位置，及两者的匹配性信息。Reference转换而成的颜色编码序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有两种情况：“单颜色不匹配”和“两连续颜色不匹配”。由于每个碱基都被独立地检测两次，且SNP位点将改变连续的两个颜色编码，所以一般情况下SOLiD将单颜色不匹配处理成测序错误，这样一来，SOLiD分析软件就完成了该测序错误的自动校正；而连续两颜色不匹配也可能是连续的两次测序错误，SOLiD