第六章 基因工程及其应用(克隆)10

基因工程及其应用

GeneticEngineeringandItsApplication

将基因进行克隆，利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质（多肽）或定向改造基因结构所用的方法和相关工作统称基因工程（geneticengineering）。

Geneswerecloned,usingtheclonedgeneexpression,preparationofspecificproteins(peptides)ormodifiedgenestructureorientedmethodsisusedingeneticengineering基因工程中最主要的工作（技术）是基因克隆（genecloning），也称分子克隆（molecularcloning）、重组DNA（recombinantDNA）。挑出所要群落得到纯系转殖菌株大量培养生产人类胰岛素HumanInsulin探针

Probe互补

DNA专一性抗体送入宿主细菌基因接入载体目标基因剪接基因工程Dolly---theworld'smostfamoussheepGender:

FemaleBreed:

MammalBirthday:

1996/7/5Homeplace:

ScotlandFather:

Nofather

Mother:

ThreemothersDeath:

2003/2/14克隆（Clone）---

来自同一始祖的相同拷贝的集合。分子克隆细胞克隆

个体克隆

(动物/植物)基因克隆(分子克隆、DNA克隆、基因重组）

gene（DNA）

cloningBergandCohenBiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972Berg----第一个重组体构建Cohen在重组DNA技术中杰出贡献ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro．

Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达.第一个有功能重组体的构建Cohen在重组DNA技术中杰出贡献

不同的酶切片段转化大肠杆菌后能够在细胞内进行重组连接形成有功能的重组质粒。这一结果也提示，如果能够在体外重组成功，并能将重组体引入细胞内，同样具有生物学功能。Significances：１.setupbridgesamongdifferent

biologicalspeciesandrealizegenetalk;２.shortenevolutionunits;３.accordingtohumanwill.基因克隆Genec

cloningDNAcloning

DNAcloningistoplacearelativelyshortfragmentofagenome,whichmightcontainthegeneorothersequenceofinterest,inanautonomouslyreplicatingpieceofDNA,knownasa

vector,formingrecombinantDNA,whichcanbereplicatesindependentlyoftheoriginalgenome,andnormallyinotherhostspeciesaltogether.PropagationofthehostorganismcontainingtherecombinantDNAformsasetofgeneticallyidenticalorganism,oraclone.ThisprocessiscalledDNAcloning.古埃及一具木乃伊的一个DNA片段已经得到克隆打开了人们窥探过去的窗户面临的问题Questions:

：基因操作和转基因的应用面临伦理、生物安全等一系列的问题。

itisconfrontedwithaseriesofquestionsreferringtoethicandbiologicalsecurityintheapplicationofgenemanipulationandtransgenetechnology.第一节

分子克隆中常用工具酶

限制性核酸内切酶

DNA连接酶

DNA聚合酶ⅠTaqDNA聚合酶

逆转录酶

碱性磷酸酶

末端转移酶

一、限制性核酸内切酶

restriction

endonuclease

是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此水解其双链dsDNA内部特异位点—磷酸二酯键的核酸酶。

.

Restrictionenzymeandmodificationmethylasewerethoughttorecognizethesamenucleotidesequenceandtogetherformarestriction-modification(R-M)system.

anaturaldefensemechanismofbacteriatoagainsttheintroductionofforeignDNAintothecell与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）识别特性：具有双链对称的回文结构

(palindrome)

↓

GGATCCCCTAGGⅡ型酶(TypeII

Restrictionendonuclease)a只有酶切活性而无甲基化修饰作用.

cutDNAmolecularinspcificalplaces.nomodification.b以内切方式水解磷酸二酯键,需mg2+.

Hydrolyzephosphatebackbonewithinrecognition.

RequireMg2+.C切割位点严格、精确；识别序列呈回文结构，通常为4、6碱基；产生’粘端和钝端’切口末端。

recognizeandcutspecificsymmetricalsequence.Mostrecognitionsequencesare6bp.Yieldbluntendorsticky5`-or3`-end.

BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口切口：平端切口、粘端切口Restrictionsequences5’protrudingends3’protrudingendsCohensiveends特殊性质的Ⅱ型限制性内切酶

同裂酶（isoschizomers）又称异源同工酶：从不同原核生物中分离出来的具有相同识别位点，切割位点可以相同，也可以不同的酶。

isolatedfromdifferentprokaryotes

haveidenticalrestrictionsequences

haveidenticalordifferentdigestionsites同功异源酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶Isocaudaners:有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。

havedifferentrestrictionsequencesbutproduceidenticalcohesiveendsBamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG+A

+TCTAG

GATCTA同尾酶Isocaudaners:可变酶

识别DNA顺序中的一个或几个碱基是可变的,并且识别序列超过6个碱基对.

Thesizeofrestrictionsequencesismorethan6bpswithatleastonevariablebase.

BstpI:GGTNACC

N为可变碱基内切酶命名原则：第一个字母（大写，斜体）代表该酶微生物（寄主菌）的属名。Genus第二、三字母（小写，斜体）代表微生物的种（系）名。

speciesHindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株的第三种酶接下来的字母代表微生物的株和型。

strainandtype如果从一种菌中发现多种限制酶，则根据发现顺序用罗马字母表示。I、II、III

微生物名称酶名称识别序列

BacillusamyloliquefaciensHBamhⅠG↓GATCC

解淀粉芽孢杆菌

BacillusglobigilBglⅡ

A↓CATCT

球芽孢杆菌

EscherichiaColiRY13EcoRⅠG↓AATTC

大肠杆菌

HaemophilusinfluenzaeHindⅢA↓AGCTT

流感嗜血菌

Providenciastuartii164PstⅠCTGCA↓G

普罗威登细菌

StreptomycesalbusSalⅠG↓TCGAC

白色链球菌应用中的问题

限制性内切酶广泛应用于分子生物学研究的各个领域。

Restrictionendonucleasehasbeenusedinallfieldsofmolecularbiologystudy.Somequestionsofitsapplication二.DNA连接酶（DNAligase）

可催化双链DNA相邻碱基5，磷酸和3`羟基间形成磷酸二酯键。因而可以把两个DNA分子连接在一起.DNAligasescatalyzeformationofaphosphodiesterbondbetweenthe5'phosphateofonestrandofDNAandthe3'hydroxyloftheanother.ThisenzymeisusedtocovalentlylinkorligatefragmentsofDNAtogether.

T4噬菌体DNA连接酶T4DNAligase

：

①催化两个独立DNA片段5`-P和3`-OH之间形成磷酸二酯键

Catalyzingtheformationofaphosphodiesterbondbetweenjuxtaposed5'phosphateand3'hydroxylterminiinduplexDNAorRNA②修复双键DNA中一条链上的缺口。

repairingsinglestrandednicksinduplexDNA,RNAorDNA/RNAhybrids.

③反应需要ATP提供能量.requiresATPasenergy三、DNA聚合酶（DNApolymerase）1.大肠杆菌DNA聚合酶ⅠEscherichiaColi

DNApolymeraseⅠ：

5`-3`聚合酶活性polymeraseactivity

5`-3`外切酶活性

exonucleaseactivity

3`-5`外切酶活性exonucleaseactivity

Applications:

DNA缺口平移反应制备探针

DNAnicktranslationinordertoproduceprobes;

cDNA第二链的合成

cDNAsecondchainsynthesizingDNA3`末端的标记

DNA3`endtagging;DNA测序DNAsequencing

。

Klenow片段(Klenowfragment)

：

DNAPolI的大片段.具有5`-3`聚合酶活性，

3`-5`外切酶活性。thelargefragmentofDNAPolI.5`-3`polymeraseactivity3`-5`exonucleaseactivity

3TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase：耐热DNA聚合酶，在70-75℃具有最佳活性，但缺乏3`-5`外切酶活性。主要用于PCR反应。TaqDNApolymeraseisatitsbestactivityat70-75℃,butitlacks3`-5`exonucleaseactivity.ItismostlyusedinPCR.4、逆转录酶Reversetranscriptase(RT)

以RNA为模板合成DNA合成的DNA产物称为互补DNA（complementaryDNA，cDNA）。anenzymethatfunctionsasaRNA-dependentDNApolymerase.

threeactivities:

5`-3`polymeraseactivity

5`-3exonucleaseactivity

3`-5`exonucleaseactivity(3`---5`exonucleaseactivity---RNaseHactivity)

常用的逆转录酶有禽类成骨细胞性白血病病毒（Avianmyeloblastosisvirus，AMV）逆转录酶

Moloney小鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus(mo-MLV）逆转录酶。

第二节分子克隆中常用的载体（vector）载体（vector）携带外源基因进入受体细胞的特殊结构的分子叫做载体（vector）。载体的本质是DNA。Inmolecularbiology,avectorisanyvehicleusedtotransferforeigngeneticmaterialintoanothercellorhostcell.

.

Cloningvectors:

tocloneageneinavectorExpressionvectors:

toexpressagenefromavectorTypesofvectorsGeneralfeaturesofaVectorAutonomouslyreplicatingDNAindependentofhost’sgenome.2.Containsatleastoneselectivemarker,whichallowshostcellscontainingthevectortobeselectedamongstthosewhichdonot.

3.Containsamultiplecloningsite(MCS)

（MCSisashortsegmentofDNAwhichcontainsmany(usually20+)restrictionsites-astandardfeatureofengineered.

4.Easilytobeisolatedfromthehostcell

5.Expressionvectors:

allowingtheexogenousDNAtobeinsertedandexpressed.PromoterandenhancerterminatorforRNAtranscriptionarerequired.

表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、增强子等调控元件。PlasmidvectersBacteriophagevectorsCosmidsEukaryotic

virusvectorvectors质粒载体（plasmidvectors

）

独立于染色体外的遗传因子，由双链环状DNA分子组成。

Plasmidsaredouble-strandedgenerallycircularDNAsequencesthatarecapableofautomaticallyreplicatinginahostcell.

多克隆位点ori复制起始点遗传标记AmppolylinkerMultiplecloningsitesMultiplerestrictionsitesenabletheconvenientinsertionoftargetDNAintoavectorAmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites,

多科隆位点）LacpromoterlacZ’…ACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA….ThrAsnSerSerValProGlyAspProLeuGluSerThrCysArgHisAlaSer…EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIHincIIAccIPstISphILacZSelectivemarkers:

twinantibioticresistance

blue-whitescreeningExample:ampR

geneencodingtheenzymeb-lactamasewhichdegradespenicillinantibioticssuchasampicillin;kanRforkanamycin.载体上的筛选标记----大肠杆菌LacZ基因

LacZ基因编码半乳糖苷酶.用含有X-gal的培养基培养细菌时，在细菌的乳糖操纵子诱导物异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落变为蓝色；如果LacZ基因被外源DNA分子的插入而破坏，则不能生成相应的半乳糖苷酶，菌落为白色。通过蓝白菌落的观察，能方便的进行基因克隆的筛选工作。LacZgeneTheLacZgeneencodesβ-galactosidase.ItisanIPTG-inducibleβ-galactosidasegenewhosespatialprofileofitsexpressionintargetcellscanbedemonstratedbyX-gal.WheninducedwithIPTG,plaquesformedbyvectorsturnbluewithX-gal,whereasthosewithclonedDNAinsertsremaincolorless.Thus,clonedinsertswillbefoundonlyinclearpaquesthatdonotturnbluewithX-gal.lacZencodeenzyme

b-galactosidase

IPTGX-gallacpromoter

BlueproductbackX-galLacZ蓝色化合物X-gal2.Bacteriophagevector从λ噬菌体颗粒中分离出的DNA分子为双链线状,dsDNA,lineargenome其末端分别具有突出的12bp的互补单链,是天然的粘性末端,称COS位点.12bpcomplementsinglechain.naturalcohensiveend(COSsite)插入型Insertionvectors

DNAProtein

coatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)置换型Replacementvectors

ReplacethenonessentialregionofthephagegenomewithexogenousDNA(~20kb)hightransformationefficiency(1000-timehigherthanplasmid)M13、fd、f1：

AfterinfectionofasensitiveE.colihost,Phageparticlesforma6.7kbcircularsinglestrandofDNA.

Thecomplementarystrandissynthesized,andtheDNAreplicatedasa

double-strandedcircle,thereplicativeform(RF)withabout100copiespercell.丝状噬菌体AfilamentousphageReplicationform(RF,dsDNA)

ofM13phagecanbepurifiedandmanipulatedlikeaplamid.Phageparticles(ssDNA):DNAcan

beisolatedinasingle-strandedformDNAsequencing基因重组转染体外包装噬菌体噬菌体体外包装粘性质粒

CosmidvectorsUtilizingthepropertiesofthephagelcossitesinaplasmidvector.2.ItallowsthetargetDNAtobeinserted

Theinsertcanbe37-52kb

Analysisofeukaryoticgenesandthegenome

vectorswitha

largercapacityforclonedDNAthanplasmidsorphage

.CloninglargeDNAfragments３.病毒virussvectors各种真核病毒载体中均含有各种相似的调控序列(regulatoryelements)，包括DNA在真核细胞中的复制起始点(ori)、启动子(promoter)、剪切位点(cleavagesite)、多聚腺苷化信号、增强子(enhancer)等。逆转录病毒载体在逆转录病毒前基因组的两端分别有一个长末端重复序列（Longterminalrepeat，LTR），其中含有启动子、增强子、整合信号及多聚A化信号等调控序列。

Bothendsofpre-genomeofretrovirushaveLTRs,containingregulatoryelementssuchaspromoter；enhancer；integrationsignaling；PolyAsignalingandsoon。

Retroviruss:

single-strandedRNAgenome,whichcopytodsDNAafterinfection.HavesomestrongpromotersforgeneexpressionGenetherapy基因克隆的基本过程

Basicprocessofcloningagene

目的基因的分离与制备

生物物种的基因种类繁多，而且每种基因均由四种核苷酸组成，理化性质接近，用一般的物理、化学的方法难以分离。Separationofgeneisdifficultbecauseoftheirsimilarphysicalandchemicalqualities

PCR可以把

指定的基因片段

数量放大染色体PCR

基因数量放大连琐反应１.聚合酶链反应获取目的基因

Polymerasechainreactionforthetargetgene

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）技术是20世纪80年代发明的一种生物技术，能在试管中将目的DNA片段在数小时内由一个拷贝扩增到数百万倍。PCR技术的发明使大量获取目的DNA片段进行DNA分子的体外操作成为可能。

PCRenablesresearcherstoproducemillionsofcopiesofaspecificDNAsequenceintubeswithinafewhours.

《后详》ScreeningfromGenomiclibraries２.通过基因组文库分离、筛选基因需要克隆的DNA片段。目的基因编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系基因组文库存在于细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合体称基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)。

ThecollectionofgenomicDNAcarriedbythecloningvectorsinbacteriaiscalledgenomicDNAlibrary.

建立基因文库后需要结合适当筛选方法从众多转化子菌落中筛选出含有某一基因的菌落。

Aftertheestablishmentofgenelibraryscreeningmethodsrequireacombinationofappropriatecoloniesfromanumberoftransformantsscreenedcoloniescontainedagene

一个理想的基因组文库应包含全部DNA序列，在进行任一基因筛选时达到99%以上的概率，这种方法类似于霰弹打鸟，因此也称为鸟枪法(Shotgunmethod)

。Acollextionofcloneswhichbetweenthemrepresenttheentiregenomeofanorganism.Theshotgunmethod(alsoknownasshotguncloning)isamethodincloninggenomicDNA.

３.通过cDNA文库分离、筛选基因

IsolatedbycDNAlibraryscreeninggene

cDNA文库由一个基因组全部mRNA基因的克隆组成的文库。从文库中可调出该基因组的任何mRNA的基因。

cDNAlibraries

：AllmRNAbyagenomeconsistingofgenelibrary.AdjustablefromthelibraryoutofthegenomeofanymRNAofthegenecDNA文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNA两种文库的比较基因组文库中，所包含的外源基因片段不仅含有可被转录和翻译的区域，还含有不能转录的序列。Genomiclibrarieshaveintrons.cDNA文库中的插入片段是由mRNA逆转录生成，可直接指导转录和翻译，能直接用于基因表达或调控方面的研究。cDNAlibrarieshavenointrons.４.人工合成基因artificialgene用化学合成技术(DNA合成仪)合成DNA分子。synthesizesDNAusingchemicalsynthesistechnology(synthesisinstrument)人工合成基因必需首先知道核苷酸序列及其他相关的基因信息。artificialgenemustfirstlyknowitsnucleophosphatesequencesanditsrelatedinformation.

化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列目的基因的获取化学合成法

cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应二、载体选择

Choicesofcloningvectors

PlasmidvectersBacteriophagevectorsCosmidsEukaryotic

virusvector三、目的基因与载体的体外重组这种DNA重组是靠DNA内切酶和连接酶将外源DNA与载体共价连接的。Thejoining,or1igation,ofDNAfragmentsiscarriedoutbyanenzymeknownasDNAligase

连接的位点位于载体的多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)。TheligationsitelocatesinMCSofvector.

DNAligation

Oneofthemostimportantstepsinacloningprocedure.

CovalentlyjointheDNAmoleculeswiththebase-pairingcohesiveends,orbluntends,ifthe5’-endshavephosphategroups几种常用的DNA分子连接方法1、粘性末端连接法

cohesiveendligationwheninsertedDNAhaveidenticalcohesiveendswithvector,asidenticalcohesiveendscanbeeasilylinkedtogetherwiththehelpofDNAligase

常用.连接效率高.commonusage,highligationefficiency

BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+载体DNA用BamHⅠ切割目的基因用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录

通常可利用碱性磷酸酶处理线性的载体分子以去除其5`端的磷酸基团，降低载体环化几率.Alkalinephosphatase

Removesthephosphategroupsfromthe5’-endsofthevectorDNAlinearizedbyasinglerestrictionenzymetopreventtheself-ligationofthevectorDNAuponthefollowedligationTheuseofalkalinephosphatasetopreventreligationofvectormoleculesG-OHCTTAA-OH用定向克隆方式，即对载体和插入片段均使用两种内切酶进行处理directionalcloning(bothinsertedDNAandvectorarerespectivelydigestedbytworestrictionendonuclease,sotheexogenousDNAcanbedirectionallyinsertedintovector）不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体目录2、平头末端连接法bluntendligation

某些DNA分子末端并不是粘性结构，而是平头结构.insertedDNAhaveidenticalbluntendswithvector

平头连接缺点:

连接效率较低;存在的双向插入和多拷贝插入问题。disadvantages:lowligationefficiency,bidirectionalinsertion,multiplecopyinsertion.

应适当增加酶量，提高反应中底物的浓度并延长反应时间。

Overcome:increasingthequantityofligase,improvingtheconcentrationofreagents,prolongingreactiontime.

目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录3、人工接头法artificiallinker

人工合成的含有常用限制性内切酶识别序列的双链DNA短片段(大小一般为8-12个碱基对)称接头(Linker).

LinkerisashortfragmentofdsDNA(8-12bp),whichisartificiallysynthesizedandcontainsrecognitionsequencesofmanycommonrestrictionendonuclease.

人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ4、同聚物加尾连接

（homopolymerictails）在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。homopolymerictailsligationTerminaldeoxyrinucleotidyltransferasecancatalyzedeoxyribonucleotidetoaddto3`-OHofssDNAordsDNAonebyone.SothepolydCtailsoflinearvectorandthepolydGtailsoftargetDNAcanbecomplementarilylinkertogetherwiththehelpofTerminaldeosynucleotidyltransferase5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体连接方式：

粘性末端连接

平头末端连接

人工接头连接

同聚物结尾连接四、重组子导入宿主细胞

Intro