第六章原核基因表达调控模式2012.5.31

第六章

基因的表达与调控（上）---

原核基因的表达调控模式本章的主要内容有：第一节原核基因表达调控总论第二节乳糖操纵子与负控诱导系统第三节色氨酸操纵子与负控阻遏系统第四节其他操纵子第五节固氮基因调控第六节转录后调控准备知识一、基因表达调控的现象和概念

基因表达调控是生命的必需基因表达(geneexpression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。

既然从DNA到蛋白质的过程称为基因表达，对这个过程的调节就称为基因表达调控（generegulation或genecontrol）。基因表达调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。基因组(genome)

是指含有一个生物体生存、发育、活动和繁殖所需要的全部遗传信息的整套核酸。但生物基因组的遗传信息并不是同时全部都表达出来的，大肠杆菌基因组含有约4000个基因，一般情况下只有5－10%在高水平转录状态，其它基因有的处于较低水平的表达，有的就暂时不表达。不同组织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因表达的强度和种类也各不相同，这就是基因表达的组织特异性(tissuespecificity)。例如肝细胞中涉及编码鸟氨酸循环酶类的基因表达水平高于其它组织细胞，合成的某些酶(如精氨酸酶)为肝脏所特有；胰岛β细胞合成胰岛素；甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)专一分泌降血钙素等。

细胞分化发育的不同时期，基因表达的情况是不相同的，这就是基因表达的阶段特异性(stagespecificity)。一个受精卵含有发育成一个成熟个体的全部遗传信息，在个体发育分化的各个阶段，各种基因极为有序地表达，一般在胚胎时期基因开放的数量最多，随着分化发展，细胞中某些基因关闭(turnoff)、某些基因转向开放(turnon)，胚胎发育不同阶段、不同部位的细胞中开放的基因及其开放的程度不一样，合成蛋白质的种类和数量都不相同，显示出基因表达调控在空间和时间上极高的有序性，从而逐步生成形态与功能各不相同、极为协调、巧妙有序的组织脏器从上所述，不难看出：生物的基因表达不是杂乱无章的，而是受着严密、精确调控的，不仅生命的遗传信息是生物生存所必需的，而且遗传信息的表达调控也是生命本质所在。

二、基因表达适应环境的变化

生物体内的基因调控各不相同，基因表达随环境变化的情况，可以大致把基因表达分成两类：①组成性表达(constitutiveexpression)指不大受环境变动而变化的一类基因表达。其中某些基因表达产物是细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而必不可少的，这类基因可称为看家基因(housekeepinggene)，这些基因中不少是在生物个体其它组织细胞、甚至在同一物种的细胞中都是持续表达的，可以看成是细胞基本的基因表达。组成性基因表达也不是一成不变的，其表达强弱也是受一定机制调控的。②适应性表达(adaptiveexpression)指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为可诱导的基因(induciblegene)；相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因(repressiblegene)。

改变基因表达的情况以适应环境，在原核生物、单细胞生物中尤其显得突出和重要，因为细胞的生存环境经常会有剧烈的变化。例如：周围有充足的葡萄糖，细菌就可以利用葡萄糖作能源和碳源，不必更多去合成利用其它糖类的酶类，当外界没有葡萄糖时，细菌就要适应环境中存在的其它糖类(如乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等)，开放能利用这些糖的酶类基因，以满足生长的需要。即使是内环境保持稳定的高等哺乳类，也经常要变动基因的表达来适应环境，例如与适宜温度下生活相比较，在冷或热环境下适应生活的动物，其肝脏合成的蛋白质图谱就有明显的不同。所以，基因表达调控是生物适应环境生存的必需。第一节

原核基因表达调控总论

本节的主要内容有：一、原核基因调控机制的类型与特点二、弱化子对基因活性的影响三、降解物对基因活性的调节四、细菌的应急反应基因表达调控主要表现在以下两方面：1．转录水平上的调控（transcriptionalregulation）；2．转录后水平上的调控（post-transcriptionalregulation），包括①

mRNA加工成熟水平上的调控（differentialprocessingofRNAtranscript）；②

翻译水平上的调控（differentialtranslationofmRNA）。第一节原核基因表达调控总论原核生物中，营养状况（nutritionalstatus）和环境因素（environmentalfactor）对基因表达起着举足轻重的影响。真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平（hormonelevel）和发育阶段（developmentalstage）是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。因为细菌mRNA在形成过程中与核糖体混合在一起，所以，细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译相耦联（coupledtranscriptionandtranslation）。真核生物中，转录产物（primarytranscript）只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。转录因子

一个基因是由基因产物的调控和表达所需要的所有DNA序列组成的。意味着在一个典型的编码蛋白质的基因中，它的启动子和上游的调节区位于基因的非转录部分，而mRNA转录区代表转录单位。被称为转录因子（transcriptionfactors）的DNA结合蛋白与基因调控区中特殊的效应元件（responseelements，RE）DNA序列相互作用，调节RNA聚合酶活性，达到控制基因转录的目的。转录因子的功能

常用转录诱导（transcriptionalinduction）（增加起始速率）和转录阻遏（transcriptionalrepression）（降低起始速率）等术语来描述转录因子的功能。诱导转录的转录因子称之激活剂（activators），而阻遏转录的称之为阻遏物（repressors）。转录因子起着激活剂作用，还是起着阻遏物的作用取决于细胞的生理状态和不同启动子之间的DNA序列差别。在原核生物中，效应分子可以是cAMP或某些小的代谢产物，而真核生物转录效应分子常常受到磷酸化作用的调节。从下图可以看到转录速率增加（诱导和去阻遏）和降低（阻遏和去诱导）的两种转录机制，主要的调节机制是DNA结合活性的调节。图20.2(a)、(b)分别表示阻遏物被效应分子抑制和激活；下图(c)和(d)分别表示激活剂被效应分子激活和抑制。

调节机制

原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为：负转录调控（negativetranscriptionregulation）正转录调控（positivetranscriptionregulation）。一、原核基因调控机制的类型与特点

在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏二大类。在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。阻遏蛋白作用的部位是操纵区。在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。也可根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态。参与大肠杆菌中基因表达调控最常见的蛋白质可能是σ因子，共存在六种σ因子，其中σ70是调控最基本的生理功能如碳代谢、生物合成等基因的转录所必须的。

除参与氮代谢的σ54以外，其它5种σ因子在结构上具有同源性，所以统称σ70家族。所有σ因子都含有4个保守区，其中第2个和第4个保守区参与结合启动区DNA，第2个保守区的另一部分还参与双链DNA解开成单链的过程。与上述σ因子特异性结合DNA上的-35区和-10区不同，σ54因子识别并与DNA上的-24和-12区相结合。在与启动子结合的顺序上，σ70类启动子在核心酶结合到DNA链上之后才能与启动子区相结合，而σ54则类似于真核生物的TATA区结合蛋白（TBP），可以在无核心酶时独立结合到启动子上。二、弱化子对基因活性的影响

属于这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子等等。

起信号作用的是有特殊负载的氨基酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。

当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称为弱化子。这种因为核糖体在基因转录产物上的不同位置，决定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构、并由此决定基因能否继续转录的调节方式确实是非常巧妙的。起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或嘧啶的浓度，因此是转录调节中的微调整，好比无线电调谐器中的微调一样，只要稍加变动就可影响整个体系的功能。三、降解物对基因活性的调节

操纵子学说的核心是使基因从表达抑制状态中解脱出来进行转录，是从负调节的角度来考虑基因表达调控的。那么，有没有从相反的角度进行正调节以提高基因的转录水平？有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，产生出代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。为什么会产生这种效应呢？因为添加葡萄糖后，细菌所需要的能量便可从葡萄糖得到满足，葡萄糖是最方便的能源，细菌无需开动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶活性，减少环腺苷酸（cAMP）的合成，与它相结合的蛋白质，即环腺苷酸受体蛋白CRP又称分解代谢物激活蛋白CAP，因找不到配体而不能形成复合物。降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式。四、细菌的应急反应

细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一二种氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。关于ppGpp的作用原理还不大清。ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛，它们不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以它们是超级调控因子。操纵子学说

法国巴斯德研究院的FrancoisJacob与JacquesMonod于1960年在法国科学院院报(ProceedingoftheFrenchAcademyofSciences)上发表了一篇论文，提出乳糖代谢中的两个基因被一靠近它们的遗传因子所调节。这二个基因为β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和半乳糖苷透过酶(galactosidepermease)。在此文中他们首先提出了操纵子(operon)和操纵基因(operator)的概念，他们的操纵子学说(theoryofoperon)使我们得以从分子水平认识基因表达的调控，是一个划时代的突破，因此他们二人于1965年荣获诺贝尔生理学奖。大肠杆菌能以乳糖为唯一碳源生长，这是由于它能产生一套利用乳糖的酶。这些酶受乳糖操纵子的控制。大肠杆菌乳糖操纵子是大肠杆菌DNA的一个特定区段，由调节基因I，启动基因P，操纵基因O和结构基因Z、Y、A组成。P区是转录起始时RNA聚合酶的结合部位。O区是阻遏蛋白的结合部位，其功能是控制结构基因的转录。平时I基因经常进行转录和翻译，产生有活性的阻遏蛋白。

Z编码β-半乳糖苷酶；Y编码β-半乳糖苷透过酶；A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶。β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。

RNA聚合酶结合部位阻遏物结合部位乳糖操纵子的控制模型，其主要内容如下：

①Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。

②这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区（P），不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。

③操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。

④当阻遏物与操纵基因结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。

⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lacmRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。

当一个mRNA含有编码一个以上蛋白质的编码信息，而且这些蛋白质都是以独立的多肽被翻译时，这样的mRNA称之多顺反子mRNA。多顺反子mRNA在细菌中是很普遍的。多顺反子lacmRNA中的lacZ，lacY，lacA经翻译生成的产物分别为LacZ（β-半乳糖苷酶（β-galactosidase））、LacY（β-半乳糖苷通透酶（β-galactosidepermease））和LacA（β-半乳糖苷转乙酰基酶（thiogalactosidetransacetylase））。

别乳糖是lac操纵子转录的活性诱导物，人们发现一个合成的、结构上类似于别乳糖、不能被β-半乳糖苷酶水解的β-半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside：IPTG）起着lac操纵子的一个诱导物的作用，所以IPTG常用于诱导含有使用了lac启动子的质粒载体的细菌中的重组蛋白的表达。

lac操纵子受LacI阻遏蛋白调控。在没有诱导剂（乳糖或IPTG）存在时，LacI阻遏蛋白与lac操纵子DNA序列结合得非常紧密，lac基因不能进行转录。当IPTG存在时，IPTG与LacI阻遏蛋白相互作用，形成LacI阻遏蛋白－IPTG复合物，体外研究表明，该复合物对lac操纵基因的亲和性为单独LacI阻遏蛋白的亲和性的千分之一。所以IPTG作为lac基因表达的一个诱导剂，起着转录去阻遏作用。就象（下图）表示的那样，RNA聚合酶的结合部位（lac操纵基因）也是LacI阻遏蛋白的结合部位，实验表明RNA聚合酶和LacI阻遏蛋白对操纵基因序列的结合是相互排斥的。

通过去阻遏调控lac操纵子只是调控的一种方式，另一调控系统也可起到lac操纵子的转录诱导作用。分解物基因激活蛋白（catabolicgene-activatorprotein:CAP）可以部分调控细菌对糖的代谢。在有乳糖存在，而且葡萄糖水平低时，CAP可以激活象lac操纵子那样的操纵子的转录。

当葡萄糖和乳糖都存在时，即使阻遏物不结合，转录也是非常弱的。然而当葡萄糖浓度降低，而乳糖仍然存在时，转录激烈增加。这是由于CAP是lac操纵子的一个激活剂，并且起始了正调控转录。cAMP的作用象个调节器，它与CAP结合正向调控CAP的DNA结合活性。E.Coli中葡萄糖转运将导致腺苷酸环化酶的去活化（作用），这使得细胞内cAMP处于低水平。因此当葡萄糖存在时，cAMP水平低，而CAP无活性。然而当葡萄糖水平低时，腺苷环化酶有活性，细胞内cAMP水平增加，导致CAP的激活，结果促进RNA聚合酶与启动子结合，使转录增强。（下图）概括了在葡萄糖和乳糖水平低和高的条件下lac操纵子的转录活性。只有当葡萄糖水平低，而乳糖存在时，lac操纵子才被最大程度地转录。当葡萄糖和乳糖的水平都很低时会出现什么现象呢？实验表明，尽管有激活的CAP存在，lac阻遏物与lac操纵基因结合仍然能够阻止RNA聚合酶与启动子结合。

Thecircuitryfortheeffectisshowninthefigurebelow.Ontheleftisthesituationforhighglucose/lowcAMPandontherightforlowglucose/highcAMP:HowdoestheCAP-cAMPstimulatetranscription?Inthefirstmodel,theCAP-cAMPinteractswiththeRNApolymerasebybindingtotheC-terminaldomainofoneofthetheasubunits.

ThesecondmodelhastheincreasedtranscriptionrateoftheoperonduetobendingoftheDNAbecauseofthebindingofCAP-cAMPSuchbindingcanbeobservedexperimentally.Infact,X-raycrystalstructuresoftheCAP-cAMPbondtoDNAshowabendingofthistype.ThebendingmightallowtheRNApolymerasetobindmoretightlytothepromoter.CAPBindingBendsDNAThisDNAbendingresultsinmoreefficientRNApolymerasebindingDNACAPLacICrystalStructureofLacIandCAPComplexedtoDNATheresultisthatthelacoperonrespondstoboththepresenceorabsenceoflactoseaswellastothelevelofglucosethecellhasavailable.HereisatablethatpresentsthesepossibilitiesintermsoflacmRNAsynthesis:PositiveControlofTranscription:CAP

Absenceofthelacrepressorisessentialbutnotsufficientforeffectivetranscriptionofthelacoperon.TheactivityofRNApolymerasealsodependsonthepresenceofanotherDNA-bindingproteincalledcataboliteactivatorproteinorCAP.CAPhastwotypesofbindingsites:OnebindsthenucleotidecyclicAMP;theotherbindsasequenceof16basepairsupstreamofthepromoterHowever,CAPcanbindtoDNAonlywhencAMPisboundtoCAP.sowhencAMPlevelsinthecellarelow,CAPfailstobindDNAandthusRNApolymerasecannotbeginitswork,evenintheabsenceoftherepressor.Sothelacoperonisunderbothnegative(therepressor)andpositive(CAP)control.CAPconsistsoftwoidenticalpolypeptides(henceitisahomodimer).TowardtheC-terminal,eachhastworegionsofalphahelixwithasharpbendbetweenthem.ThelongeroftheseiscalledtherecognitionhelixbecauseitisresponsibleforrecognizingandbindingtoaparticularsequenceofbasesinDNA.Thereareactuallythreelacoperators.TheonecommonlyshownindiagramsiscalledlacO1.Theothersaredownstream(lacO2)andupstream(lacO3)fromthisone.O2andO3arecalledauxiliaryoperators.NoticethatO2isplacedwithinthelacZreadingframe!Alsonoticetheslightsequencedifferencesbetweenthemainoperator(O1)andtheothertwo.(CAPisthebindingsiteforthecAMP:CAPcomplexandRNAPistheRNApolymerasebindingsite,otherwiseknownasthepromoter).Genetranscriptionbeginsataparticularnucleotideshowninthefigureas"+1".RNApolymeraseactuallybindstoasite"upstream"(i.e.,onthe5'side)ofthissiteandopensthedoublehelixsothattranscriptionofonestrandcanbegin.ThebindingsiteforRNApolymeraseiscalledthepromoter.Inbacteria,twofeaturesofthepromoterappeartobeimportant:asequenceofTATAAT(orsomethingsimilar)centered10nucleotidesupstreamofthe+1siteandanothersequence(TTGACAorsomethingquiteclosetoit)centered35nucleotidesupstream.ThestructureofamonomerofLacrepressoridentifiesseveralindependentdomains.PhotographkindlyprovidedbyMitchellLewis.Repressorproteinbindstotheoperatorandisreleasedbyinducer

ThecrystalstructureofthecoreregionofLacrepressoridentifiestheinteractionsbetweenmonomersinthetetramer.Eachmonomerisidentifiedbyadifferentcolor.PhotographskindlyprovidedbyAlanFriedman.

ThecrystalstructureofthecoreregionofLacrepressoridentifiestheinteractionsbetweenmonomersinthetetramer.Eachmonomerisidentifiedbyadifferentcolor.PhotographskindlyprovidedbyAlanFriedman.

ThecrystalstructureofthecoreregionofLacrepressoridentifiestheinteractionsbetweenmonomersinthetetramer.Eachmonomerisidentifiedbyadifferentcolor.PhotographskindlyprovidedbyAlanFriedman.

ThecrystalstructureofthecoreregionofLacrepressoridentifiestheinteractionsbetweenmonomersinthetetramer.Eachmonomerisidentifiedbyadifferentcolor.PhotographskindlyprovidedbyAlanFriedman.

操纵基因的鉴定

小结

1.Thelacgenesarecontrolledbyarepressor

2.Thelacoperoncanbeinduced

3.Repressoriscontrolledbyasmallmoleculeinducer

4.Repressorproteinbindstotheoperator

5.Bindingofinducerreleasesrepressorfromtheoperator 6.Repressorisatetramer

7.RepressorbindstothreeoperatorsandinteractswithRNApolymerase

8.RepressorisalwaysboundtoDNA

9.CAPfunctionsindifferentwaysindifferenttargetoperons 10.CAPbendsDNA

OrganizationofLacOperonandLacIOperonpromoterRibosomeinitiationTheLacOperon:

WhenGlucoseIsPresentButNotLactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveComeon,letmethroughNowayJose!CAPTheLacOperon:

WhenGlucoseAndLactoseArePresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveCAPLacRepressorRepressorXRNAPol.RNAPol.Great,Icantranscribe!Sometranscriptionoccurs,butataslowrateThislactosehasbentmeoutofshapeTheLacOperon:

WhenLactoseIsPresentButNotGlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThislactosehasbentmeoutofshapeCAPcAMPCAPcAMPBindtomePolymeraseRNAPol.RNAPol.Yipee…!TheLacOperon:

WhenNeitherLactoseNorGlucoseIsPresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBindtomePolymeraseRNAPol.RepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveRepressorSTOPRighttherePolymeraseAlright,I’mofftotheraces...Comeon,letmethrough!第二节乳糖操纵子与负控诱导系统本节的主要内容有：一、乳糖操纵子二、正调控和负调控一、乳糖操纵子1调控位点(1)Operator操纵基因(2)CAP(catabolitegeneactivationprotein)orCRP(cAMP受体蛋白)结合位点(3)Promotor2别乳糖为诱导物3本底组成型(backgroundconstitutivesynthesis)组成型(constitutivegene)即看家基因（Houskeepinggene)诱导物

的加入

和去除

对lacmRNA

的影响二、正调控和负调控正调控负调控诱导(induction)阻遏(repression)诱导物(inductor)阻遏物(repressor)辅阻遏物(corepressor)使阻遏蛋白具有活性或使活性蛋白失去活性的物质称～。第三节

色氨酸操纵子与负控阻遏系统本节的主要内容有：一、trp操纵子的阻遏系统二、弱化子与前导肽三、trp操纵子弱化机制的实验依据

lac和ara操纵子是编码分解代谢途径酶系的操纵子，负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操纵子的表达受相应碳源的诱导。在细菌中还有负责一些物质合成代谢的操纵子，例如色氨酸操纵子（tryptophanoperon,trpoperon）就是负责色氨酸合成的操纵子。trp操纵子是由一个启动子和一个操纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合成需要的5种蛋白的多顺反子mRNA的表达。

一、色氨酸（trp）操纵子

由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的α和β亚基。trpE基因是第一个被翻译的基因，和trpE紧邻的是启动子区和操纵区。另外，前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa（不是trpA）。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处，而前者则位于90分钟处。在位于65分钟处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。二、弱化子与前导肽

（一）弱化子

在trpmRNA5'端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，其中123～150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样。当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录，这就是123～150区序列缺失会提高trp基因表达的原因。因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。

研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。（二）前导肽实验表明衰减作用需要负载tRNATrp参与，这意味着前导序列的某些部分被翻译了。分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA；如果翻译起始于AUG，应该产生一个含有14个氨基酸的多肽。这个假设的多肽（还未实际观察到）被称为前导肽。

前导序列具有一个非常有意义的特点，在其第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。这一点很重要，因为组氨酸操纵子中，也具有弱化子，也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有7个相邻的组氨酸密码子。苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有7个苯丙氨酸密码子。这些密码子参与了trp及其他操纵子中的转录弱化机制。（三）mRNA前导区的序列分析

trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对（图6-22），有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。RNaseT1降解实验（此酶不能水解配对的RNA）表明，纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4的配对方式，由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。（四）转录弱化作用

转录的弱化理论认为mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对tRNATrp的浓度敏感。当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。而当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止，trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸（图6-24）。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。ThetrpoperonisnegativelyregulatedbytheTrprepressorTrprepressorbindsitstargetDNAsequenceonlywhenititselfisboundbyitsco-repressor,tryptophan.Thetrpoperatorisapalindromic

DNAsequencetrp操纵子转录的调控是通过Trp阻遏物实现的，它结合于trp操纵基因序列

，但Trp阻遏物的DNA结合活性直接受色氨酸调控，色氨酸结合Trp阻遏物，并起着一个效应分子的作用（也称之辅阻遏物）。在有高浓度色氨酸存在时，Trp阻遏物-色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且紧密结合于trp操纵基因序列，因此可以阻止转录。然而当色氨酸水平低时，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活。

三、trp操纵子弱化机制的实验依据trp操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用（attenuation）的调控机制，这是一种将翻译与转录联系在一起的新的转录调控形式。细胞内Trp-tRNATrp浓度决定核糖体是否停留在trpmRNA中的前导序列内的两个连续的色氨酸密码子处。当色氨酸水平高和Trp-tRNATrp可利用时，起转录终止作用的发卡环结构（由区3和区4之间）形成，RNA聚合酶刚好在一个聚尿嘧啶的下游处脱离DNA模板，转录终止。当由于细胞内色氨酸有限，Trp-tRNATrp水平低时，核糖体就停留在RNA中连续的一对色氨酸密码子处。核糖体这一瞬间的停留给出时间使得一种替换的发卡结构在新的RNA中（由区2和区3之间）形成，是一种抗终止的RNA结构，它破坏了转录终止信号，使得RNA聚合酶能够继续沿着DNA模板滑动完成转录。

ThetrpoperonP=promoterT=terminatorO=operatortrpRtrpAPOPTTPolycistronicmRNA(encodes5proteins)mRNATrpR(repressor)5separateproteinsthatweresynthesizedfromonemRNAtrpBtrpCtrpDtrpEAttenuatorTrpRAttenuationinthetrpoperonEffectivelyaddsafinetuningtotheregulationofthetrpoperon.Severalkeypoints:Transcription&translationaretightlycoupledinbacteria(attenuationrequiresthis).SynthesisofaleadersequencerichinTrpinfluenceswhethertranscriptionofthetrp

operoniscomplete.If[Trp]isadequatetranscriptionisterminatedbeforethetrp

operon.If[Trp]isinadequatetranscriptioniscompleted.TerminationoftranscriptionisdeterminedbyleadermRNAsequence.Attenuation–atranscriptionalformofcontrol

mRNAleadersequenceAttenuator110140trpELeaderpolypeptide14aawith2Trpaa1162TypicalstemloopofTerminationsiteAttenuation12344231mRNATrpcodonsmRNAsectionsbasepairswith2basepairswith4ONLY3+4generatetheterminationsiteAttenuation–Inadequate[Trp]1234mRNATrpcodons2314Ribosomestalls

duetolow[Trp]Thislargestemloopof2+3doesNOTactasaterminator.Transcriptioncontinues!!RNApolymeraseAttenuation–Adequate[Trp]1234431RibosomemovesRapidlyalongmRNAmRNAsectionsbasepairswith4toformaterminationsite,suchthatRNApolymeraseprematurelyfallsoffthemRNAandabortsfurthertranscription.mRNAAttenuationworksbyhavetheRNApolymerasestop(terminate)beforethetranscriptionofthestructuralgenes,butAFTERithasalreadystartedtomakeanRNA.ThekeyistheregionoftheoperoncalledtrpL(seethefiguresabove).ThetrpoperonofE.coliIntryptophan-poormediumIntryptophan-richmediumOperonSummary

Wehaveconsideredindetailthreeoperons:thelacoperon,thearaoperon,andthetrpoperon.Thefirsttwoareoperonsconcernedwiththecontrolofcatabolicprocesses(utilizationofenergysubstrates)whilethethirdisconcernedwithanabolicprocesses(synthesisofamoleculethecellneeds).Allthreesharenegativecontrolfeatures,usingrepressorproteinsbindingtooperatorstoplacetheoperoninthe"off"state.Thefirsttwohavepositivecontrolfeaturesthatincreasetranscriptioninresponsetolowglucose(CAP-cAMPbindingtotheCAPsite).Thisisnotthecaseforthetryptophanoperon.Thetryptophanoperon,however,hastheadditionalnegativecontrolfeatureofattenuation.Thesefeaturesaresummarizedinthefollowingtable:consensusTATA(Pribnow)boxE.coliPromoters

AllostericEffectorsBindingcanalsoberequiredforbindingofrepressor(e.g.Trp)orcanblockanactivator.GenomicOrganizationoftheTrpOperon

TheTrpOperon

Notethattheorderofthegenesfollowstheorderofthebiosyntheticpathway!!ControlofGeneExpressionintheTrpOperonTheenzymecatalyzingthefirststepinthepathwayisinhibitedbyTrp(feedbackcontrol).InthepresenceofTrp,arepressorproteinbindstoanoperatorupstreamoftheTrp

operonandshutsofftranscriptionAttenuation.Thereisa160basepairregionintheTrpmRNAthatcausestranscriptiontoterminateprematurelyifTrpispresent.FeedbackControl

TranscriptionalControlAttenuationControlAttenuationControlHighTrpLevels

Ribosomeproceeds

Loop3/4forms

TranscriptionterminatesLowTrpLevels

Ribosomestalls

Loop2/3forms

TranscriptioncontinuesTrpOperonControlledbyAttenuationtrpR

PO1234trpEtrpDtrpCtrpBtrpAattenuatorLeaderattenuationcanformundercertainconditionsbase-pairingcanoccurbetween1-22-33-4Attenuation149HighlevelsofTryptophaninCelltranscription&translationoccursimultaneouslyinProkaryotesleadertranscript(1)has2trp

codons(UGGUGG)ribosomesmovesfastalongtranscriptstem-loop3-4forms,polyUsafterearlyterminationoftranscription,

translationstops(onlyleaderpeptideforms-hasnofunction)150LowLevelsofTryptophaninCellribosomestallsatUGGUGGinleadertranscript(1)stem-loop2-3forms,nopolyUaftertranscriptioncontinues151LowLevelsofotherAminoAcidsribosomestallswayearlystem-loops1-2&3-4form,polyUafterearlyterminationoftranscription152TheTrpOperon:

WhenTryptophanIsPresentSTOPRighttherePolymeraseTrpTrpRepressorRepressorRepressorPromo.trpDtrpBLead.OperatortrpAtrpCtrpEAten.RNAPol.FoiledAgain!RepressormRNAHeyman,I’mconstitutive3’5’5’3’TranscriptionAndTranslationInProkaryotesRibosomeRibosome5’mRNARNAPol.

Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-AAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACA-AUG-AAA-GCA-AUU-UUC-GUA-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser-STOPCUG-AAA-GGU-UGG-UGG-CGC-ACU-UCC-UGA-AACGGGCAGUGUAUUCACCAUGCGUAAAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUU

Met-Gln-Thr-Gln-Lys-ProUUUU-GAACAAAAUUAGAGAAUAACA-AUG-CAA-ACA-CAA-AAA-CCGtrpE...TerminatorTheTrpLeaderandAttenuator4123ThemRNASequenceCanFoldInTwoWays4123Terminatorharipin41233’5’5’3’TheAttenuator

WhenStarvedForTryptophan4123RNAPol.RibosomeHelp,IneedTryptophan3’5’5’3’TheAttenuator

WhenTryptophanIsPresent4123RNAPol.RibosomeRNAPol.第四节

其他操纵子本节的主要内容有：一、半乳糖操纵子二、阿拉伯糖操纵子三、多启动子调控的操纵子大肠杆菌半乳糖操纵子(galactoseoperon)包括3个结构基因：

异构酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)，

半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactosetransferase,galT)，

半乳糖激酶(galactosekinase,galk)。这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。GalR与galE、T、K及操纵区O等离得很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。一、半乳糖操纵子gal操纵子的特点：

①它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；

②它有两个O区，一个在P区上游-67--53，另一个在结构基因galE内部。因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，gal操纵子仍可被诱导。现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（gal结构基因高效表达）；而另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的gal基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类。

分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅5bp的启动子，可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时，转录从S1开始，当无cAMP-CAP时，转录从S2开始。

为什么gal操纵子需要两个转录起始位点？

半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就有能合成异构酶。假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（S1）对高水平合成进行调节。MapoftheE.coligaloperonandnucleotidesequenceoftheregulatoryregion组氨酸操纵子与His降解代谢有关的两组酶类被称为hut酶(histidineutilizingenzyme)，控制这些酶合成的操纵子被称为hutoperon。由一个多重调节的操纵子控制，有两个启动子，两个操纵区及两个正调节蛋白。

Hut操纵子共编码4种酶和一个阻遏物。4种酶分别由hutG、hutH、hutI及hutU基因编码，阻遏物则由hutC基因编码。在产气克氏菌中，以上基因构成两个转录单位，hutI、hutG、hutC和hutU、hutH分别被转录合成两条mRNA长链。这两个转录单位各自都有一个启动子和一个操纵区，其转录过程都是从左向右进行的，hutC阻遏物能与每个操纵区相结合。无论以组氨酸作为唯一碳源或氮源，hut操纵子都会处于有活性状态。Hut操纵子的每一个启动子上都有cAMP-CAP结合位点，当碳供应匮乏时，能合成cAMP，出现cAMP-CAP复合物，并与操纵区上的相应位点结合，诱发基因转录。虽然尚不清楚氮源缺乏时的信号是什么，但它很可能也是一个正效应子。

在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因：araB、araA和araD，它们形成一个基因簇，简写为araBAD

二、阿拉伯糖操纵子E.Coli的ara操纵子（arabinoseoperon）中的araB基因、araA基因和araD基因分别编码阿拉伯糖代谢需要的三种酶：

核酮糖激酶（ribulosekinase），

阿拉伯糖异构酶（arabinoseisomerase）

核酮糖-5-磷酸差向异构酶（ribulose-5-phosphateeimerase）。

三个基因的表达受到ara操纵子中第4个基因araC产物转录因子AraC的调控。

ara操纵子的调控有三个特点：第一，araC表达受到AraC的自动调控。第二，AraC既可充当阻遏物，也可作为激活剂。第三，AraC与CAP结合可充分诱导ara操纵子。

与araBAD相邻的是一个复合的启动子区域和一个调节基因araC，这个AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。AraBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。在标准的遗传学图谱上，araBAD基因簇从启动子PBAD开始向右进行转录，而araC基因则是从Pc向左转录。

AraC蛋白作为PBAD活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的。Pr是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合，而Pi是起诱导作用的形式，它通过与PBAD启动子结合进行调节。在没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与Pr的结合，使Pr离开它的结合位点，然后，产生大量的Pi，并与启动子结合。因为培养基中含有葡萄糖，所以cAMP-CAP没有与操纵区位点相结合，AraC蛋白处于Pr形式并与A位点结合，RNA聚合酶很少再与Pc结合，araC基因虽然仍有转录，但受到抑制，只有少量AraC蛋白形成，整个系统几乎处于静止状态。没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖，因为没有诱导物，尽管有cAMP-CAP与操纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区B位点相结合，无araBADmRNA转录。无葡萄糖，有阿拉伯糖时，大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与操纵区B、A位点相结合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。araC的表达受到自身产物AraC的自动调控。当没有阿拉伯糖时，AraC起着一个转录阻遏物的作用。细胞中AraC蛋白质稳态水平的测量表明，阻遏araC转录大约需要40个AraC。因此当AraC蛋白水平低时（就是说在细胞刚分裂之后），araC将表达直至存在足够的AraC去阻遏它的转录。

阿拉伯糖作为E.Coli的碳源，可以诱导ara操纵子的转录。当细胞中葡萄糖水平高（导致cAMP处于低浓度）和阿拉伯糖水平低时，AraC阻遏araB，araA，araD的转录。

然而当阿拉伯糖水平高，而葡萄糖水平低（cAMP高）时，CAP-cAMP复合物能够与ara操纵子中的CAP结合部位结合，使DNA突环打开。

阿拉伯糖的作用象AraC的一个调控器，可将AraC由一个阻遏物转换为一个激活剂。阿拉伯糖与AraC结合似乎改变了AraC同源二聚体化特性和促进了AraC-CAP复合物的形成。在这样的条件下，AraC－阿拉伯糖的作用象是一个转录激活剂，这正是CAP-cAMP诱导araB，araA，araD转录所需要的。

当由于araBAD编码的蛋白质的代谢使得阿拉伯糖水平下降时，AraC又转换成一个阻遏物，同时araBAD转录减少，此时尽管CAP-cAMP复合物仍然存在于细胞中。有趣的是，当葡萄糖和阿拉伯糖都很丰富时，ara操纵子被阻遏，但阻遏的道理现在还不完全清楚，但这个结果表明araBAD诱导与AraC-阿拉伯糖和CAP-cAMP复合物都有关。

WhenthearaCproteinisboundtotheoperatoraraO1,transcriptionfromPCisprevented.Whenarabinoselevelsarelow,theAraCproteinactsasarepressorandbindstotwooperatorsites,araO1andaraO2,aswellastoaraI.Bindi