微生物大实验 2

微生物期末实验总结微生物期末实验总结酸奶中菌种的分离与鉴定2013年1月1日设计背景1.1酸奶中菌种:市售酸奶中主要益生菌有保加利亚杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌。可能存在的杂菌有酵母菌、大肠杆菌，以及在生产运输过程中可能感染上的霉菌。近几年由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下降，导致疾病越治越多，健康受到极大的威胁。所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，在我国生产销售的酸乳及酸乳饮品数量直线上升,品种花样繁多,很受消费者的青睐。酸奶是以新鲜牛乳经有效杀菌,用不同乳酸菌发酵剂制成的乳制品,味酸甜细腻,营养丰富,深受人们喜爱,专家称它是“21世纪的绿色食品”,是一种“功能独特的营养品”。它对人体有较多的好处,可以维持肠道正常菌群平衡,调节肠道有益菌群到正常水平等。因此，从发酵乳制品中分离性能优良的乳酸菌，制作真正的健康、绿色的食品，对促进我国发酵乳制品工业的发展具有重要的意义。目前市售的各种酸奶制品中,作为发酵剂的乳酸菌,通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。1.2研究意义：此实验是为了让我们了解酸奶中的益生菌及其可能生长的杂菌，为此我们进行了多个品牌的酸奶及多个浓度梯度进行检验与测定，以本学期学过的知识加深与巩固对微生物实验学习与应用能力。虽然无法保证在设计及操作过程中可能出现的误差，但本小组以科研精神为原则，在实践中克服困难，完成设计预期的各项任务，获得成果，虽然实验操作对于生物科学这条道路浅显，但这种对做事认真负责的态度和经历往组员们能带到今后的学习生活中增添辉煌！设计方案：2.1材料及设备：伊利、蒙牛、光明三种品牌的原味酸奶（含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌）老酸奶。试剂：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、琼脂等。仪器：：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿、试管、300ml三角瓶、移液管、天平、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、锥形瓶、烧杯、酒精灯、石棉网、接种针（环）、擦镜纸等。2.2涉及培养基：Mrs培养基、普通培养基、土豆培养基、蛋白胨水培养基、酵母培养基。2.3整体思路：根据三种市场主要销售的酸奶在不同梯度稀释后培养进行益生菌数目对比，之后进行划线分离将数类菌种分离出再培养，鉴定出主要菌种进行菌种形态的鉴定与观察，用多种培养基进行培养检验是否存在杂类细菌、真菌及霉菌。实施方案：3.1培养基的制备：当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH值降低再在MRS培养基上加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。但是，无抗生素，只能用普通的MRS培养基。乳酸细菌培养基（MRS）蛋白胨10.0g牛肉膏10.0g酵母膏5.0g柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7]2.0g葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g吐温801.0mL乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH6.2~6.63.2益生菌的分离鉴定对三种品牌的酸奶进行浓度梯度稀释10（-4）、10（-6）、10（-8），接种至mrs培养基，一段时间后对培养物进行观察，对培养基内菌落进行划线分离，分离出的菌类进行菌种鉴定（包括菌落、外表、大小、基本形态）及个品牌益生菌数目的比较。3.3杂菌的鉴定：检验酸奶中的杂菌酸奶中的杂菌可能有酵母菌，大肠菌群等检验有无肠杆菌群的方法主要是检验大肠杆菌乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。最好用的方法为3M纸片法，但无3M纸片只能用普通方法1.霉菌的检验：对三种品牌的酸奶进行梯度稀释10（-4）、10（-5）、10（-6），接种至土豆培养基，一段时间后对观察培养皿中情况，对长出的菌落进行鉴定。2.真菌及酵母菌的检验：对三种品牌的酸奶进行稀释10（-4）、10（-5）、10（-6），接种至酵母培养基，48h后进行观察及菌种鉴定。3.杂细菌的检验：主要可能存在杂菌为大肠杆菌，对三种品牌的酸奶进行稀释10（-4）、10（-5）、10（-6），接种至普通培养基，一段时间后进行检验与观察，包括美兰活菌染色，革兰氏染色、鞭毛染色进行分离与鉴定。4．生理生化实验鉴定法：进行糖发酵实验结果与讨论：4.1各品牌酸奶梯度浓度的结果品牌/浓度10（-4）10（-6）10（-8）光明两个培养皿中菌都很多，有白色的成片菌落，其中一个有大片红色区域，另一个红色区域很少。白色红色表面都粗糙，有褶皱，且都不透明一个培养皿边缘有少量成片杂菌，杂菌呈白色，不透明，另一个无杂菌菌落屋杂菌菌落，乳酸菌菌落也很少蒙牛一个培养皿无杂菌菌落，另一个培养皿有较多杂菌菌落，较大面积，连成片呈淡黄色不透明的菌落，连成片，表面粗糙两个培养皿乳酸菌菌落几乎没有，其中一个有少许杂菌菌落，边缘有透明的呈淡黄色的菌落看不到菌落伊利其中一个培养基内只见杂菌菌落，且成白色，不透明，表面粗糙，有褶皱。第二个还有两大块菌落，形状不规则，表面粗糙，呈淡黄色，边缘为红色其中一个培养皿中杂菌菌落为棕色菌落，不透明，表面粗糙，边缘不规则，还有黄色菌落，不透明，表面粗糙，边缘不规则。另一个培养基内杂菌为白色和淡黄色的菌落，不透明，表面粗糙，边缘不规则。其中一个培养基无杂菌菌落。另一个有大量白色和淡黄色的菌落，不透明，表面粗糙，边缘不规则。和伊利10-6第二个培养基中的菌落很像。鉴于我们组不知道是杂菌，后来在培养中培养了好多杂菌，大多为大片白色菌落，不透明，有褶皱。至于个品牌益生菌数目，在实验允许误差下我们认为蒙牛＞伊利＞光明4.2优势菌种的分离与鉴定4.2.1双歧杆菌的鉴定过程：通过酸奶的稀释、涂布培养、分离划线及培养之后，在MRS培养基上出现了不同的菌落。双歧杆菌的菌落形态是中型的乳白色圆点，表面光滑，湿润。整个菌落凸起，不透明，且边缘光滑完整。 挑取菌落的少量细菌进行制片观察，通过革兰氏染色的操作，在显微镜下观察到菌体呈蓝紫色，证明其为革兰氏阳性菌。 第二次制片，切换到高倍镜下时，大致能够观察到菌体末端呈分叉状，凭借这个特征和所用酸奶的菌种介绍，初步确认所分离的菌种是双歧杆菌。 为了进一步验证所分离的菌种是双歧杆菌，进行第二次划线并打算根据生理生化实验的现象进行确认。但是第二次划线培养后的培养基中出现了杂菌污染。 重新稀释、涂布、划线分离后，做了吲哚实验。但是吲哚实验的现象不够明显。综上所述，所分离的菌种确认是双歧杆菌。4.2.2嗜热链球菌的鉴定过程：菌落细小光滑，湿润微白色，边缘整齐，且镜检结果为细胞呈卵圆形，成对或形成长链的鉴别为嗜热链球菌。菌体细胞呈卵圆形，测微尺测得直径为0.7－0.9um，成对或形成长链，平板培养基时细胞膨胀变粗，有时会呈杆菌状，革兰氏阳性。兼性厌氧，最适生长温度为38-43℃；糖发酵实验测得乳糖、葡萄糖均可被降解，产酸产气。4.2.3保加利亚乳杆菌的鉴定：保加利亚乳杆菌形态：菌体长约2-9um,宽约0.5-0.8um,呈单个体长杆状。细胞两端钝圆，呈细杆状。培养特性：在mrs培养基上培养,菌落为无色到淡白色,通常呈不光滑状,直径1-3mm左右。利用MRS琼脂培养基对保加利亚乳杆菌进行分离,分别挑取可疑菌落进行革兰氏染色,对镜检结果为革兰氏阳性菌,且细菌形状为杆状的菌种进行糖发酵试验生物化学鉴定.结论:在MRS琼脂培养基上,菌落较大、透明、灰白色,镜检细菌形状为杆状,乳糖发酵阳性的菌种,认定为保加利亚乳杆菌。4.2.4嗜酸乳杆菌鉴定过程：镜检下为链杆状或球杆状，镜检所得直径大约为1~2um，两端圆。其菌落较小，不规则，呈圆形，乳白色。嗜酸乳杆菌为革兰氏阳性菌，吲哚试验呈阴性，形态呈细长杆状，最适生长温度为３５-３８℃。生理生化实验检测出能利用葡萄糖、乳糖进行同型发酵。4.2.5根据实验结果及网络查询资料，我们制出以下表格：菌种生长特性实际培养温度菌落形态菌体形态备注保加利亚乳杆菌属于革兰氏阳性，厌氧性菌。菌体长约2~9um宽0.5~0.8μm，单个体呈长杆状或成链，两端钝圆，不具运动性，也不会产生孢子。40℃菌落较大，不光滑，通常为无色到淡白色，透明网络截图革兰氏染色呈蓝色，属阳性菌；糖发酵实验乳糖、葡萄糖可被降解；产酸产气镜检嗜热链球菌革兰氏阳性细菌，同型发酵，兼性厌氧。卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性嗜热链球菌会长成米色的菌落网络截图革兰氏染色呈蓝色，属阳性菌；糖发酵实验乳糖、葡萄糖可被降解；产酸产气镜检嗜酸乳杆菌革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形菌落形态嗜酸乳杆菌菌落较小,微微隆起,不规则,呈圆形,乳白色,光滑,有光泽,直径1~2mm,挑起托丝粘稠,无特有色素,用放大镜观察,深层显示缠绕,或微毛丝状网络截图革兰氏染色呈蓝色，属阳性菌；镜检乳双歧杆菌双歧杆菌属革兰氏阳性、厌氧、不运动、无芽孢、形态多变的杆菌菌落光滑,凸圆边缘完整,乳脂呈白色,闪光并有柔软质地。网络截图革兰氏染色呈蓝色，属阳性菌；吲哚实验显红色，可产生吲哚；糖发酵实验乳糖被分解；产酸产气镜检4.3镜检益生菌数目因菌类种类过多，在稀释过后菌落分散不均匀，无法进行有效的数据分析，此实验内容放弃。4.4杂菌的分离与鉴定1．霉菌：在12片土豆培养基上无任何菌落的生长，做多次对比以及实验误差排除之后，我们认为在浓度为10（-4）及以下浓度的各品牌酸奶中都不存在霉菌或霉菌的浓度低于此次实验所能检测的水平。2.大肠杆菌：5.收获和感谢经过两周半的实验和最后的课程设计撰写，本课题最终定稿。本次课题虽然与其余三组所选一样，但我们仍希望我们能与他人