植物植物非寄主抗性

植物植物非寄主抗性

1非寄主植物基因突变体hrp基因的表达通过共同的发展，只有少数微生物在一定植物中建立了生态位。庆幸的是,这一致病生态位通常情况下在相同的植物种类上,并不适合大多数的微生物。从这一意义出发,就可以说这一植物对这些不能成功侵染的微生物表达了非寄主抗性(nonhostresistance),这也属非亲和互作类型。这种类型在自然界广泛存在。抗性在植物中是普遍现象,感病仅是例外。另一方面,微生物从腐生、寄生向共生方向进化,能够致病的病原物仅是少数。人工接种一种植物上的病原物至另一非寄主植物上,或一感病品种上的病原物至另一抗病品种上,常可见过敏性反应(hypersensitiveresponse,HR)。这种现象最早在Ward(1902)研究的雀麦冠锈病(Pucciniadispersa)中就发现了。二十世纪30～50年代,人们在研究病毒鉴别寄主和研究专性寄生菌致病性分化的鉴别品种上发现有枯斑反应(necrosisresponse)。1964年,Klement等人发现革兰氏阴性植物病原细菌在非寄主植物上有过敏性反应。70～80年代,Kuc等人提出ISR(Inducedsystemicresistance),现称为系统获得抗性(SAR,Systemicacquiredresistance)。1984年,Callow在描述植物——微生物互作发育关系时首次阐述植物和病原物在物种水平上的不亲和性为非寄主抗性,并指出非寄主抗性是由病原物产生的激发子与非寄主感受蛋白识别后激发产生诱导抗性的结果。1986年,Lindgren等克隆出丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonassyringaepv.phaseolicala)的hrp基因。hrp基因突变体不能在非寄主或非亲和寄主上产生HR,也不能在亲和寄主植物上致病(陈功友等,2000)。1987年Boucher等报道青枯假单胞菌(P.solanacearum)的dsp(diseasespecificpathogenicity)基因表型。dsp突变体在亲和的寄主植物上不致病,但在非寄主植物上可激发HR。1992年,Wei等人从梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)中分离和表达能够激发非寄主植物——烟草产生HR的harpin蛋白激发子。Yu等人(1995)从致病疫霉(P.parastitica)中分离出引起烟草HR和诱导烟草SAR的激发子elicitin。1996年,Alfano等人明确了引起非寄主HR的harpin分子的活性片段。1997年,Kamoun证实烟草对elicitin的识别决定了其对P.infestans的非寄主抗性。Jackson等人(1999)在P.syringaepv.tomato中证实了致病岛(pathogenicityisland)的存在。董汉松等人(1999)证明,非特异性激发子harpinEa诱导的SAR是由水杨酸(salicylicacid,SA)这一信号传导途径进行的。近几年来,病原菌致病相关基因及其产物在非寄主植物上的作用以及在非寄主植物上引致HR和SAR过程中的识别、信号传递和调控防卫基因表达,成为分子生物学和分子植物病理学研究的热点领域,与此同时,研究寻找植物抗病反应的R基因及其产物结构与功能的多样性规律,尤其是非寄主植物抗病反应信号传递上游的共同机制,引起植物病理、生理和育种学家的广泛关注。2hrp基因族一般而言,非寄主抗性主要发生在识别的早期和随之产生的HR和/或SAR,或者非寄主抗性在非病原物(nonpathogen)或非亲和病原物(imcompatiblepathogen)能否成功侵入寄主植物的决定时期得以表达。从目前已克隆的R基因来看,其产物结构多具膜蛋白性质,在识别、信号传递过程中起Avr受体作用。avr产物具两种功能(bakeretal.,1997):一方面具小种-专化性负调控作用,即avr突变或失去功能,则病原物的寄主范围扩大;另一方面,具特异性识别对应的R功能,识别后经信号传递,调控防卫基因表达,在非亲和寄主植物上产生HR。R和avr都存在着各自的共有保守序列(commonconsensussequences)(Lindgren,1997)。hrp基因族的主要功能是编码组成Ⅲ型分泌系统(He,1998;Galanetal.,1999),有些hrp基因产物,如harpin,可在非寄主植物上激发HR和诱导SAR(陈功友等,2001)。另外,研究表明,hrp对avr转录其调控作用,所有的丁香假单胞菌的avr都可能是与hrp基因协同调控的。因此,植物育种家们希望能把对一非病原物或一非亲和性病原物侵染具抵抗性的非寄主抗性基因转移至能受此病原物侵染的寄主植物上,借助HR和/或SAR机制,不受种、专化型、小种-专化性的限制而拓宽转基因植物抗病谱。与此同时,植物病理学家们也正试图揭示植物-非亲和性病原物间互作机制,寻找病原物致病灾变规律(病原物寄主范围和致病性进化的物质基础),把病原物致病相关基因进行改造,使之成为寄主上的非亲和性病原物并发挥激发子(elicitor)的作用,诱导植物具有HR和/或SAR机制。3非寄主植物的特性毫不奇怪,作为植物病原物的微生物经进化,已能产生一些酶类来消解不同的植物成分,如角质层、胞壁、中胶层、植保素等,甚至其本身的胞质成分,或者所产生一些产物都可能有激发非寄主植物产生HR和/或SAR的能力。如果非寄主抗性因毒素而被征服或消失,或者人工热激或用代谢抑制剂降低抗性,则许多原来不能侵入植物的非病原物就能有效侵染(Heath,1991)。这就提出一些疑问:非寄主抗性的本质是什么?这些反应是如何被信号激发的以及非寄主植物如何抑制病原物侵染的?3.1引起三性侵风险的细胞松弛素Kobayashi等人(1995)以豌豆白粉菌(Erysiphaepisi)接种大麦叶鞘细胞时发现,由于非寄主大麦叶鞘细胞中的微丝和微管在侵染位点下聚集、核移向侵染位点和原生质向侵染位点极性集中而形成乳突,因而使E.pisi不能侵入。当用具破坏微丝作用的细胞松弛素A处理大麦叶鞘细胞时,包括E.pisi在内的其它不是大麦上的病原菌,如Alternariaalternata、Colletotrichumgraminicola、Cornesporamelonis、Micosphaerellapinodes等,都能有效侵入。细胞松弛素处理的大麦、小麦、烟草和黄瓜,都能被E.pisi侵染。Gross等人(1993)也观察到非病原菌Phytophthorainfestans在侵染大麦细胞时的类似情况发生。因此,植物细胞骨架在非寄主抗性中可能起三个作用:(1)防卫相关反应的极化作用(趋向侵入位点);(2)信号传递(因微丝和微管而加速信号传递);(3)毗邻细胞间的信号交流(通过存在于胞间连丝中的肌动蛋白微丝(actin)起作用)。3.2rp基因和harpin蛋白的病原菌细菌最具说服力的应该是植物病原细菌的hrp基因及harpin蛋白的发现。许多革兰氏阴性植物病原细菌在非寄主上激发HR的能力与其在寄主上引致病害的能力是相关的,即在非寄主植物上失去激发HR的突变体,在寄主植物上也失去其致病性。目前已分离和纯化出hrp基因和harpin蛋白的病原细菌有(表1):梨火疫病菌E.amylovora(Weietal.,1992)、菊欧氏杆菌E.chrysanthemi(Baueretal.,1995)、胡萝卜欧氏杆菌胡萝卜致病变种E.carovotorapv.carovotora(Cuietal.,1996)、丁香假单胞丁香致病变种P.syringaepv.syringae(Heetal.,1993)、丁香假单胞大豆致病变种P.syringaepv.glycinea和蕃茄致病变种P.syringaepv.tomato(Prestinetal.,1995)以及水稻黄单胞菌Xanthomonasoryzae(陈功友等,2001)等。迄今为止,已在下列几方面明确了hrp基因产物harpin分子的一些共性。3.2.1harrisin分子具有明显的生物学功能①引致非寄主植物产生HR和②诱导植物产生SAR,③耐热性,harpin分子经100℃处理10分钟,诱导非寄主产生HR的能力不会丧失。3.2.2harpencc与harpiech具的相似性同一属的病原细菌产生的harpin在核酸和蛋白质序列上同源性较高,如harpinEcc与harpinEch具72.1%的相似性、53.4%的同一性,harpinEcc和harpinEa具66.6%的相似性和50.8%的同一性,特别是靠近C端约50%的部分,具有90%以上的相似性和同一性(Bauer,1995)。3.2.3植物细胞型分泌系统已明确,avr基因转录取决于hrp调控系统,Avr依赖Ⅲ型分泌系统被注入植物细胞中。小种专化性的Avr-R介导的HR需功能性的hrp分泌系统,但在非寄主上的HR并不需要Avr-R的介导(Lindgren,1997)。3.2.4harpin信号传递从现有试验证据可大致推测,harpin通过Ⅲ型分泌系统泌出到胞外,与植物细胞壁上的受体结合(目前未克隆到此受体),引发K+/H+的跨膜交换、活性氧迸发。大量的活性氧如H2O2,可引发植物细胞编程死亡(PCD,programmedcelldeath),表型为HR(Desikan,1998;Dongetal.,1999)。Harpin与外源的H2O2都可启动植物细胞主动的自杀性细胞死亡,诱导植物防卫反应(defenseresponse,DR)基因表达,如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、邻氨基苯甲酸合成酶(ASA1)等基因的表达。但是,harpin与外源过氧化氢是通过不同信号途径诱导植物细胞编程死亡和防卫基因表达的(Desikan,1998)。Harpin可以启动两个不同信号传递途径,一是导致活性氧产生和PAL、GSTmRNA的表达,另一个是导致GST和ASA1表达的增加。Baker等人(1997)指出,诱导表型为SAR的hapin分子,其作用机理类似于SA。现已清楚,harpin诱导的SAR是通过SA这一信号传导途径进行的(Dongetal.,1999)。harpin结构与功能的关系,研究报道得还不多。Alfano等人(1996)研究表明,HrpZpss的N端的153个氨基酸片段、N端109个氨基酸片段、C端216个氨基酸片段都具有引起HR的活性。据推测,harpin分子至少有四个结构域:(1)诱发HR(可能为PCD)的结构域,(2)诱导产生SAAR的结构域,(3)与Ⅲ型分泌系统互作的结构域,(4)与反应专一性有关的结构域(harpin本身不能在其寄主范围内的植物上引起HR)。3.3非宿主抗性一种植物对非自身病原真菌的抗性虽然可以从预存性抗病机制(包括结构性的和化学性的)和主动防卫机制方面找到证据,但普遍认为,这些非寄主抗性是受诱导表达的。3.3.1植物细胞活性变化Hadwiger(1994)长期研究豌豆-茄腐镰孢菌菜豆专化型(Fusariumsolanif.sp.phaseoli)系统中的非寄主抗性。他认为,非寄主抗性是植物细胞和外来病原物细胞间强烈的细胞不亲和性(intensecellimcompatibility)造成的,保持细胞生命力(viability)是非寄主抗性的关键。在菜豆茄腐镰孢菌和非寄主豌豆互作中,病原菌和豌豆细胞间的生理接触,能使各自的水解酶类与其多聚体底物相结合,如β-葡糖酶和几丁质酶与真菌中的β-1,3葡聚糖和几丁质相结合,真菌的果胶水解酶与植物的果胶相结合,真菌核酸酶和蛋白酶与植物的核酸及蛋白底物相结合,随后产生许多片段,用作信号分子。β-葡聚糖酶和几丁质酶可直接影响真菌生长,分别消解真菌伸展菌丝顶端的葡聚糖和几丁质胞壁多聚体,产生脱乙酰壳多糖(chitosan)。Chitosan低聚体(主要为七聚体heptamer)能在豌豆-茄腐镰孢菌菜豆专化型互作的30分钟内到达植物细胞核。Chitosan具有改变植物DNA构象的能力,使含有防卫基因的染色体形成loop,便于转录表达。Chitosan有两种功能(Dean,1997):限制F.solanif.sp.phaseoli的萌发和生长;激发寄主反应,直接或间接改善寄主细胞活性。寄主细胞活性持续时间越长,病原菌就越能被有效抑制,这一时期积累的胼胝质、木质素、植保素等就越多。植物防卫反应蛋白的积累,包括几丁质酶和β-葡聚糖酶,可进一步降解真菌胞壁从而释放低聚体Chitosan。3.3.2elicidn的活性及诱导植物hr的结构域分析虽然目前还不能证明非寄主抗性中存在激发子—受体模式,但已经发现能够在非寄主上产生HR和诱导SAR的蛋白质因子,其中疫霉属真菌的10kD的肽类物质elicitin和糖蛋白研究得比较清楚(表1)(Perezetal.,1997)。已有12种elicitin的全序列被分析出来,它们都由98个氨基酸组成,相互间的序列同一性大于60%。初步明确,elicitin引起HR的结构域与诱导SAR的结构域在分子的不同部位,并且鉴定出与诱发HR活性关系最密切的13号氨基酸残基。Kamoun等人(1997)证明,烟草对elicitin的识别决定了其对马铃薯晚疫病菌(P.infestans)的非寄主抗性。一般认为,疫霉菌的elicitin是通过结合植物细胞膜上的受体蛋白来激活信号传递系统,调控防卫基因表达,从而诱导植物产生SAR。从以上分析可以看出,不同病原物,在非寄主植物上引致HR和/或诱导SAR,是激发子与寄主感受蛋白识别后激发产生诱导抗性的结果。在这种情况下,病原物产生的激发子很可能是非特异性激发子,寄主的感受蛋白能接受一种或多种非特异性信号。4非病毒抗性和非亲和性非寄主抗性与小种—专化性抗性和诱导抗性有关。病原物在找到致病生态位的同时,植物种借助种间杂交和随后的选择,通过突变、不等交换、基因漂移和基因重组等机制,抗性得到进化。单一孟德尔抗性基因R,常表现为串联重复基因座位的特征(Hammond-Kosacketal.,1997),它能使植物对病原物种中的小种具有小种—品种专化性抗性。抗性常由寄主中单一显性基因R和病原物中单一显性基因avr匹配决定(基因对基因互作)。从进化角度上看,虽然病原物的avr由于具有串联重复基因痤位的特征(Ericetal.,2000),使其致病多样性处于主导地位,但非寄主植物对病原物的侵染的抗性却是普遍的,特别是那些存在基因对基因关系的病原物接种到非寄主植物上,常可见非寄主抗性,表型上多为HR和/或SAR(Sequeiral,1979)。另外,遗传上不具有病害抗性鉴别特征的植物常产生所谓诱导抗性(inducedresistance)反应。当一植物预先用一无毒性的微生物接种,就会产生对一有毒性的病原物的诱导抗性。结果,有毒性的病原物的致病过程受到阻挠。还有一类诱导抗性,即,用一亲和性病原物挑战接种,也能诱导抗性反应,它能推迟随后接种在毗邻叶片上相同病原物的侵染。诱导抗性还可在应用某一化合物来激发病害抗性反应的发生。诱导抗性可以应用代谢抑制剂、热激等来干扰抗性反应过程,使非寄主抗病性的级联反应受到阻挠(Keen,1992)。这表明,在一定情况下,如果某一植物能针对某一挑战病原物迅速和全面地产生反应,则这一植物就具有抵抗几乎任何病原物侵染的防卫机制。非寄主抗性主要包括预存性抗病机制和诱导性主动防卫机制。在非寄主抗性中虽然也可能存在基因对基因关系,但不会是每一种植物对每一种潜在的病原物都有一个抗病基因。根据DeWit(1991)的界定,基因对基因关系只是横向考察植物—微生物互作的一个视点,只能反应植物与病原物双方的适应与敌对。在这一过程中,双方都有对另一方遗传变化的连续性遗传跟踪能力。植物—微生物共同进化在使一部分微生物成为病原物的同时,也使植物按两种机制获得对病原物的抵抗能力,一种是组成型的,包括非寄主抗性和非亲和互作中的寄主抗性,它们在受到病原物的初侵染时就能表达;另一种是诱导抗性,它需要在转录和翻译水平上协同调控,这也是植物—微生物协同进化赋予植物的能力。Leach等认为,病原物与非寄主植物间的识别过程可能还有另一类异源无毒基因的参与。如,Magnaporthegrisea是水稻和许多杂草的病原菌,来自非寄主画眉草的分离物含有独特的无毒基因avr-Co39、avr-M201及avr-YAMO,带这些无毒基因的菌株是水稻的非病原菌。M.grisea之所以成为水稻的病原菌,可能是在进化中失掉了这些异源无毒基因。因此,DeWit(1991)认为,非寄主抗性,除了因为对应的非病原物缺少特定致病因子外,拥有大量无毒基因可能是一重要因素。5生态活性化合物HR是非寄主抗性中的常见表型,表现为局部的细胞快速死亡。虽然在小种专化性抗性中,细胞死亡是R-avr互作中诱导的生理生化变化的直接结果,但非寄主抗性中HR表型并不需要R-Avr的介导,外源H2O2也可诱发PCD。一般认为,HR过程中包括活性氧中介物(reactiveoxygenintermediated,ROIs)导致产生的活性氧迸发、防卫相关基因表达、膜势能改变、脂氧合酶活性增强,胞壁修饰、木质素沉积以及产生抗菌物质,如植保素等。ROIs在非寄主植物抗性中起关键信号作用(Bakeretal.,1997)。ROIs的产生,有些情况下需要Ca2+和离子通道的活化,它能在elicitor作用的几分钟内发生。ROIs可能直接激发HR或细胞死亡以及随后诱导防卫相关基因表达。一种哺乳动物DADPH氧化酶抑制剂二联苯胺碘(diphenyleneiodonium)可阻断ROIs的产生和防卫反应,这表明在植物中也需要这一类似系统。拟南芥的某些突变体,可以用来解释非寄主抗性以及非寄主抗性中HR和SAR的信号传递。5.1植物细胞抑制子基因植物中的HR受遗传控制。在几种植物上发现了在无病菌侵染情况下自发产生HR的突变株。拟南芥(Arabidopsis)植物可在lsd1和acd2位点产生突变,在无病原物侵染的情况下能形成自我繁育坏死斑、表达PR蛋白以及产生水杨酸。lsd1基因控制类似病害病斑(lesionsstimulatingdisease)的产生,acd2基因具加速细胞死亡(acceleratedcelldeath)的功能。这说明,野生型植物可能编码了HR的抑制子,该抑制子可能是正常生长的植物所共有的。同时也表明,非寄主抗性的HR表型是病原物的某种产物抑制了该抑制子活性的结果。该抑制子可能是植物共有的。5.2sa和lasd2SAR与SA是否产生及PR蛋白是否表达有关。SAR和PR蛋白表达需要SA。SA是否作为诱导植物产生SAR的远距离系统信号,目前仍不清楚。拟南芥的几种突变体有助于探讨产生SAR的信号机制。cpr1和lsd2突变体表现出SA水平增加和PR基因组成型表达,并且对毒性病原细菌和真菌的抗性增强。lsd2植株表现为组成型病斑表型,这说明LSD2编码一负调控因子,作用在SA合成或感应的上游或作用于HR的下游。另一类型的突变位点,npr1和nim1,在对病原物侵染具有抗性反应中可诱导HR和SA积累,但经SA这样的化学诱导剂处理时不表达PR基因。因此,NPR1可能作用于SA积累的下游。NPR1编码的蛋白,含有锚蛋白重复,它可在许多真核生物蛋白中发现,具有蛋白—蛋白互作介导的多重功能(Grantetal.,1995)。NPR1可能起PR基因表达转录调控因子的作用。5.3vrrpt2和verpp3的抗菌