细胞破碎分离

1常见的细胞壁结构细胞破碎技术本章的主要内容2细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。33.1细胞壁结构对破碎的影响微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。41.细菌细胞壁结构组成成分：肽聚糖（peptidoglycan）:主要成分组，它是难溶性的聚糖链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；氨基酸：D,L-丙氨酸；D-谷氨酸；L-赖氨酸磷壁酸：醛糖磷酸酯的聚合物；仅在革兰氏阳性菌中存在；糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖等脂质：不多，仅在于革兰氏阴性菌中破碎细菌的主要阻力：是来自于肽聚糖的网状结构。5672.酵母细胞壁的结构葡聚糖：它构成了细胞壁的骨架，使细胞具有一定的形状；最里层。糖蛋白:在葡聚糖上面甘露聚糖：最外层。由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在内部有甘露聚糖-酶的复合物。破碎酵母细胞壁的阻力：主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。83.真菌的细胞壁真菌的细胞壁较厚，主要由多糖，蛋白质和脂类组成。大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。9红面包霉菌细胞壁结构：最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。真菌细胞壁的结构示意图真菌细胞壁的强度：主要决定于聚合物的网状结构，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度更高。10微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质4.微生物不同细胞壁的组成和结构115.植物细胞壁的结构对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～3μm），富有弹性。初生壁的组成：主要是多糖和蛋白质；多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。许多纤维素形成微纤丝。细胞壁的机械强度：主要来自于微纤丝。1213植物次生细胞壁次生细胞壁：植物细胞生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。14木质素的网状结构显微镜图纤维素半纤维素15分类作用机理适应性机械法研磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作；大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作非机械法生物法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离；溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离；但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活3.2常用的细胞破碎技术16机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱生物法破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理171.机械法机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速研磨破碎法（beadgrinding）超声波破碎法（ultrasonication）18作用机理：高压液体剪切力1）高压匀浆法（High-pressurehomogenization）细胞悬浮液从高压室针形阀喷出，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。19高压匀浆机20高压匀浆法适用的范围适用于大规模细胞破碎☆高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。☆不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌21操作压力：升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。细菌种类：破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素22影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：

ln[1/(1-R)]=KNPɑ

式中R—破碎率N--循环次数K－与温度有关的常数P－操作压力ɑ－与微生物种类有关的常数232）研磨法beadmill作用机理：固体剪切力细胞悬浮液与细小的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨。研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在工业规模的破碎中，常采用高速研磨机WSK卧式高效全能研磨机24研磨机破碎作用方程破碎作用符合下列公式：

ln[1/(1-R)]=KtR—破碎率；K一速度常数；t一时间。K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度，循环速度，研磨剂量，颗粒大小，以及温度等相关。253）超声波破碎作用机理：液体剪切力超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz（千赫）的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的频率有关。26超声波破碎的机理一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。27超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于高浓度微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。缺点：超声波产生的化学自由基能使某些敏感性活性物质失活。对冷却的要求非常高，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。28技术原理效果成本举例匀浆法(孔型)使细胞受到液体剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理研磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理超声波法使细胞受到液体剪切力而破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理不同机械破碎方法的比较292.非机械法非机械方法很多1)生物法-酶溶解（enzymelysis）2)化学法溶胞（chemicaltreatment）3)物理法渗透压冲击（osmoticshock）冻结和融化（freezingandthawing）干燥法其中酶溶解法和化学溶胞应用最广30

1)生物法（酶溶法Enymaticlysis)生物法是利用溶解细胞壁的酶处理细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。A.外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶31特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。32有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时（1）先加入蛋白酶溶解蛋白质-甘露聚糖结构，（2）再加入葡聚糖酶溶解葡聚糖层，（3）最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。33B.自溶作用

自溶作用是酶溶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。34某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素等，可以改变细胞壁或膜的渗透性，从而使胞内物质有选择地渗透出来。2)化学渗透法（Chemicalpermeation）35酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质，使某些组分从细胞内渗漏出来。优点：成本低，反应激烈、速度快缺点：不具选择性。A.酸、碱处理法36细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；非离子型如TritonX-100和吐温（Tween）等B.表面活性剂表面活性剂是都是两性的，既能和水作用也能和脂作用；对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏磷脂层，使某些胞内物质释放出来。能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解。37能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等C.有机溶剂38通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度化学渗透法特点：缺点对产物释放有一定的选择性可使一些较小分子量的物质（多肽和小分子的酶蛋白）透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。优点393)物理法渗透压冲击法冻结-融化法干燥法40A.渗透压冲击法渗透压冲击是较温和的一种破碎方法将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），使细胞脱水收缩；再放入水或缓冲液中，使细胞快速膨胀破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。41B.冻结-融化法

将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。作用机理：一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。42使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质C.干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥4344选择破碎方法的依据：细胞处理量；细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；目标产物的选择性释放45破碎率的测定细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。

直接测定法目的产物测定法导电率测定法采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如：采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。46用巴氏染色液（中性红）染色47破碎技术的研究方向多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。48与上游过程相结合在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂(如青霉素)，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。49

讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究

一.化学法

20%(W/V)大肠杆菌悬浮液+丁酯

37℃搅拌高速离心测上清液酶活。1.处理时间

R%

3h2.丁酯用量条件：3