蛋白质组学研究中糖基化发生规律的研究进展

蛋白质组学研究中糖基化发生规律的研究进展

尽管垃圾处理项目的重大进展提供了关于遗传因素的基本信息，但这些基因的功能需要进一步澄清。弄清相关的翻译后修饰是揭示基因功能的一个重要前提。目前有报道的翻译后修饰超过150种，其中磷酸化和糖基化研究较多。蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，约有一半以上的蛋白质发生了糖基化。越来越多的数据表明，糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质功能有着重要影响。例如糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用；免疫系统中几乎所有的关键分子都是糖蛋白；近来发现蛋白质丝氨酸、苏氨酸残基的乙酰氨基葡糖（O-GlcNAc）化与信号转导有密切关系；而蛋白质糖基化程度及糖链结构的异常变化则常是癌症及其他疾病发生的标志。糖基化现象普遍存在于细胞外环境的蛋白质中，如膜蛋白、分泌蛋白和体液中的许多蛋白，这些蛋白也是在诊断、治疗过程中最容易接触到的，因而许多诊断标志物及治疗的靶标如乳腺癌中的Her2/neu、前列腺癌中的前列腺特异性抗原、卵巢癌中的CA125等都是糖蛋白。许多具有特殊生理功能的糖蛋白在哺乳动物细胞中重组表达后已作为药物用于临床，如重组组织纤溶酶原激活剂（rt-PA）、重组人促红细胞生成素（rEPO）等；我国目前在研的糖蛋白类药物有重组人尿激酶原（rhProUK）、重组人血小板源生长因子（rhPDGF）等。最近人糖蛋白已经在酵母中成功表达得到具有均一糖链结构的产物，使得糖蛋白类药物的大规模生产成为可能，并将有助于糖蛋白的构效关系的相关研究。糖基化研究的重大理论及应用意义吸引着越来越多的科学家投身于这一领域，使得糖生物学上、中、下游各研究领域逐渐呈现全面繁荣的景象，糖生物学研究也正在成为继核酸、蛋白质之后生命科学中又一极具潜力的研究领域。分析技术的进步在糖生物学发展过程中始终是直接的推动力，正是由于前所未有的分析技术进步才最终导致了糖生物学研究的全面繁荣。蛋白质组学技术的出现为包括糖生物学在内的许多传统学科的发展注入了新的活力，近来在蛋白质组学背景下进行的糖生物学研究-糖蛋白组学已经取得了可喜的进展。但是许多制约糖生物学发展的问题依然存在，目前蛋白质组学水平的蛋白质糖基化研究面临2个突出问题：一个是糖蛋白分离富集/非糖蛋白去除问题，另一个是二级质谱的裂解效率问题。因为糖蛋白常是相对量比较少且糖基化具有不均一性，传统的分离方法一般难以将糖蛋白与大量的非糖蛋白分离开来；而且鉴定糖基化位点需要质量比较高的二级图谱，目前广泛应用的CID、PSD等裂解技术经常不能满足要求。实际上，这也是蛋白质组学中其他翻译后修饰研究如磷酸化、泛素化等共同面临的问题。此外，随着蛋白质组学研究领域的急剧扩展，蛋白质组学正迅速向其他生命科学的传统学科渗透，与日俱增的大量不同的生物学问题等待蛋白质组学的方法来解决，这也要求蛋白质组学技术不断发展创新。因此，蛋白质组学技术就其面临的任务来讲还不完备，形势的发展迫切要求新的技术突破。下面就蛋白质糖基化的特点、相关研究技术现状及发展趋势从蛋白质组学研究的角度作一综述。1氨基蛋白质分析的基本特征及其对分析技术的影响1.1糖链的组成及结构参与糖链构造的单糖很少，主要是己醛糖及其衍生物，包括D-葡萄糖（主要以N-乙酰葡糖胺的形式）、D-甘露糖及D-半乳糖等共10种左右。根据所连糖基的不同，哺乳动物和植物糖蛋白大致可分为3类：N-糖蛋白，糖链通过N-乙酰葡糖胺与处于保守序列N-X-S/T(X可以是除脯氨酸外的任意氨基酸）中的天冬酰胺相连；O-糖蛋白，糖链与丝氨酸或苏氨酸相连；与糖磷脂锚（glycosylphosphatidylinositolanchor,GPIanchor）相连的糖蛋白。N-连接的糖链都有1个三甘露糖-壳二糖核心，根据外围分支（“天线”）的不同可分为高甘露糖型（highmannose）、杂合型（hybrid）和复杂型（complex)3种，后2种是在高甘露糖型的基础上经进一步加工形成的。O-连接的糖链要复杂的多，组成从一个单糖到巨大的磺酸化的多糖不等，没有一个一般的核心结构，糖基化位点也没有一个保守的氨基酸序列。GPIanchor是一种糖脂，通过酰胺键与蛋白质的羧基端相连，从而将该蛋白固定在膜上。目前研究较多的是N-糖蛋白和O-糖蛋白。国内有关蛋白质糖基化的报道还比较少。1.2糖基化的不均一性蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即在糖基化发生过程中会产生一系列结构相关的糖链（微不均一性）以及同一糖蛋白中的不同糖基化位点连接有不同的糖链（点不均一性）。这是由于糖基化的发生不同于多肽链的合成，不受DNA的直接控制，而是由糖基化相关的几种酶协调作用完成的，受各种生理生化条件的影响很大，造成即使同一个位点也会有糖基化程度不同的产物。比如人红细胞CD59在一个糖基化位点上有超过100种不同的糖链，而在所有符合N-糖基化位点保守序列的N-X-S/T中也只有约三分之一发生了糖基化,这种糖基化程度的不同使同一肽链因所带糖基的不同而呈现多种多样的“糖形”。糖基化的不均一性给糖蛋白的分离分析带来了很大的困难。首先，不同糖形的同一糖蛋白会在电泳上呈现弥散的条带（SDS）或多个深浅不同的点（2DE），造成同一蛋白在不同的点上得到鉴定或者由于信号的分散造成较低丰度的蛋白得不到鉴定；糖基化的不均一性同样会造成糖蛋白在色谱中不能得到良好的分离。其次，在质谱分析中由于糖基化不均一性的影响，糖蛋白经常表现为一簇分辨率很差的峰，得不到准确的分子量；在利用肽质量指纹图谱（PMF）法鉴定蛋白质时，同一肽段由于带有不同的糖链会表现为多个不同的质荷比（m/z），从而干扰蛋白的鉴定；在用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法进行蛋白质鉴定时，同一肽段的信号同样会因分散而减弱，得不到好的二级图谱。蛋白质糖基化研究的另一个难点在于与肽相连的糖基在CID或PSD的条件下非常脆弱，PSD或CID分析糖肽最常见的碎片离子对应于失去糖基后的完整肽段，其他带糖或不带糖的碎片离子都很少见，提供的结构方面的信息很少，丢失了糖基化位点的信息，也造成了蛋白鉴定的困难。此外，糖基化程度高的蛋白特别是那些有着成簇的O-糖链的蛋白经常对蛋白酶作用有抵抗力，造成酶解效率下降；而且不能被考马斯亮蓝很好地染色，因而在分析时有可能被忽略。虽然估计有超过50%的蛋白发生了糖基化，但现有数据库条目中只有约10%注释为糖蛋白，也从另一方面反映了蛋白质糖基化研究的难度。1.3糖链结构解析技术全面的蛋白质糖基化分析应包括以下几个方面：(1)蛋白质是否发生了糖基化？(2)是O-糖基化、N-糖基化还是其他形式的糖基化？(3)糖基化位点在哪个氨基酸残基上？(4)糖基化位点连接的是经过较少加工（高甘露糖型）的糖链还是经过充分加工（复杂型）的糖链？(5)某一特定位点连接了几种不同的糖链？此外，要阐明糖链的一级结构还应包含以下几个方面的内容：糖链的单糖组成；糖苷键在糖环上的连接位置；单糖的差向异构（α或β）、绝对构型（D或L）以及环型（呋喃糖或吡喃糖）；单糖的连接顺序；糖链上非糖取代基（磷酸基或磺酸基等）的连接位置。上述目标使分析工作面临巨大的挑战，目前还没有任何一种分析技术能解决以上所有问题。在糖链结构解析方面应用最广泛的是质谱（MS）技术和核磁共振（NMR）技术，2种技术各有利弊,在应用中经常可以互补。MS的最大优势是其很高的灵敏度，可以精确地测定质量，在某些情况下还可以得到糖链序列方面的信息；但是MS不能区分参与糖链构造的各种单糖的同分异构体，也不能提供连接位置、差向异构等结构方面的信息。NMR是惟一能够提供糖链结构方面所有信息的技术，但灵敏度低，对样品纯度要求高，目前在天然样品的分析中无法得到广泛应用。近年来侧重糖蛋白中糖链部分的分析方法有一些相关报道，但一直没有突破性的进展，当前还不具备规模化直接分析糖链组成、结构的技术条件，这也是长期以来糖类研究滞后于核酸、蛋白研究的一个主要原因。虽然还存在许多问题和不足，蛋白质组学已经形成了包括电泳、色谱，生物质谱及生物信息学工具在内的自成体系的一套技术平台。以生物质谱为核心的这套体系在糖结构分析方面尽管有其局限性，但在蛋白质/多肽分析中已经取得了巨大的成功。鉴于此，当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系以糖蛋白/糖肽中的蛋白/肽部分为重点研究对象，分离富集糖蛋白/糖肽，消除糖基化的不均一性及其对质谱分析的影响，质量标记糖基化位点，从而扬长避短，利用现有技术体系实现大规模高通量糖蛋白及糖基化位点的鉴定。2糖蛋白组技术的现状和发展趋势2.1分散和集中技术2.1.1glyco-catch法凝集素是一类对不同种类糖有特异性亲和力的蛋白质，长期以来被用于糖类的相关研究。多种不同来源、具有不同糖亲和性的凝集素已经被分离出来，许多凝集素已经成为商业化产品。日本学者最近提出一种被称为“glycocatch”的凝集素亲合技术，用于糖蛋白/糖肽的分离富集，该方法已被成功地用于商品化糖蛋白（牛胎球蛋白、鸡卵清蛋白、转铁蛋白）以及简单生物线虫和鼠肝、人血清等复杂样品。“glyco-catch”大致包括以下几个步骤：(1)糖蛋白通过凝集素亲合色谱得到富集；(2)所得糖蛋白利用对赖氨酸具有很强专一性的蛋白酶Lys-C进行酶解；(3)酶解产物再次通过第(1)步的亲合色谱富集得到糖肽；(4)得到的糖肽经过反相高效液相色谱分离；(5)对每一馏分里的糖肽测序；(6)根据序列信息进行数据库检索从而鉴定糖蛋白、确定糖基化位点。不同的凝集素有着针对不同糖基的特异的亲合性，如伴刀豆凝集素（ConA）对甘露糖（Man）有特异的亲合作用、麦胚凝集素（WGA）对乙酰葡糖胺（GlcNAc）有特异的亲合作用等，样品可依次通过不同凝集素进行分类富集。关于“glyco-catch”法已有相关综述详细介绍。诸如此类大规模分离富集鉴定糖蛋白的研究被称为“糖蛋白组学（glycoproteomics）”。凝集素亲合技术是目前糖蛋白组学中应用最广的分离富集技术。该技术迄今最成功的应用是Kaji等利用伴刀豆凝集素亲合富集线虫中的糖蛋白，利用PNGaseF酶介导的稳定同位素标记N-糖基化位点，鉴定了250个N-糖蛋白，其中83个是膜蛋白，同时确定了400个N-糖基化位点。2.1.2质谱条件的优化用酰肼试剂修饰经氧化处理的糖是一种传统的糖化学研究方法。Zhang等将这种方法应用于糖蛋白/糖肽的富集大致包括以下几个步骤：(1)氧化，利用高氯酸盐将糖环上的邻二醇氧化成醛；(2)连接，醛基与酰肼树脂上的肼反应从而共价连接到固相的树脂上；(3)蛋白酶解，对固相化的糖蛋白直接在树脂上进行蛋白酶解，洗去非糖肽，糖肽还留在树脂上；(4)同位素标记，用氘代琥珀酸酐和非氘代琥珀酸酐分别标记不同样品的α-氨基以实现质谱定量；(5)释放，用PNGaseF处理将N-糖基化的肽从树脂上释放；(6)分析，用毛细管液相色谱-电喷雾串联质谱（μLC-ESIMS/MS）或毛细管液相色谱-基质辅助激光解吸附串联质谱（μLCMALDIMS/MS）对糖肽进行分析和数据库检索。这种方法的一个优点是可以一次性不选择地富集不同类型的糖蛋白/糖肽，然后使用不同方法依次洗脱，比如用PNGaseF酶法释放N-糖蛋白/糖肽，β-消除法释放O-糖蛋白/糖肽。Zhang等利用此法分析细胞质膜蛋白和人血清蛋白，初步显示了其用于血清、细胞质膜等富含糖蛋白样品分析的优势。2.1.3分离纯化糖肽亲水相互作用色谱（hydrophilicinteractionliquidchromatography,HILIC）是一种采用极性固定相和非极性流动相的色谱技术，以前多用于分析小的极性分子，也用于分析多肽、糖肽。Hagglund等利用HILIC从胎球蛋白（fetuin）的胰酶解产物分离得到胎球蛋白的包含其3个糖基化位点的糖肽，并成功地将这种方法与凝集素亲合技术结合用于来自一维凝胶电泳的糖肽的分离富集。这种方法利用了糖肽由于糖链的加入而增强的亲水性。2.1.4采用同位素标记法进行o-glcnac位点的分析通过β-消除米氏加成反应（β-elemination/Michaeladditionreaction）在修饰位点处连上1个具有较强反应活性的基团比如巯基，从而可以选择性富集目的蛋白/多肽，这种方法被成功地用于磷酸肽的富集。Wells等借鉴磷酸化研究方法利用β-消除后DTT或生物素戊胺（biotinpentylamine,BAP）米氏加成的方法使原O-糖基化位点被标记，标记后的多肽可以通过亲合的方法富集，而且通过采用同位素标记的试剂有望实现定量和比较分析。Wells等利用该方法鉴定了鼠脑突触蛋白（synapsin）Ⅰ中的3个已知和3个新的O-GlcNAc位点并成功地将该方法用于核孔复合物（nuclearporecomplex)O-糖基化分析。该方法为在蛋白质组学的水平上进行规模化的O-糖蛋白鉴定及O-糖基化位点确定提供了范例。2.2msms检测糖蛋白目前基于质谱分析的糖蛋白鉴定一般先对糖基化位点进行特异的质量标记，使之与理论质量有一个差异，然后通过质谱分析检测到这种差异，鉴定糖蛋白，进而通过MSMS检测是在哪个氨基酸残基上发生了这种变化从而确定糖基化位点。也可以通过检测在质谱的气相离子反应过程中由糖链引起的特定质量变化（比如中性丢失、特定的子离子的存在）来鉴定样品是否发生了糖基化。2.2.1天冬酰胺的用量这是目前糖蛋白组学研究中应用最为广泛的一种N-糖蛋白鉴定方法。肽∶N-糖苷酶F(peptide∶N-glycosidaseF,PNGaseF）几乎可以作用于所有的N-糖链，同时使天冬酰胺转变为天冬氨酸，造成相对分子质量增加0.98，从而起到质量标记N-糖基化位点的作用。PNGaseF去糖基化反应的条件和胰蛋白酶几乎一致，而且可耐受一定浓度的变性剂，可以在溶液条件下或胶内进行顺序酶解，应用十分方便。这种方法的最大不足在于不能区分自发脱氨基和酶促去糖基化，这2种反应的结果是一样的，都造成N向D的转化，而自发脱氨现象在样品处理中是常见的。其次，0.98的质量差异以某些质谱仪难以区分。另外，PNGaseF对于N-糖链五糖核心中与天冬酰胺相连的GlcNAc上以α-1-3形式连有岩藻糖（fucose）的糖链不起作用。2.2.2糖基化位点标记作用与PNGaseF不同，内切-β-N-乙酰葡糖胺酶H(endo-β-N-acetylglucosaminidaseH,EndoH）在去糖基化时会将N-糖链五糖核心中与天冬酰胺相连的GlcNAc以外的部分切除，而在糖基化位点处留下GlcNAc，从而起到标记糖基化位点的作用。糖基化位点处的GlcNAc使该天冬酰胺残基相对理论质量增加了203，所以对质谱准确度要求不高。EndoH酶最适pH为5～6，在pH4和pH8时仍保持30%的活力。其性质惊人的稳定，可抗蛋白酶作用，反复冻融不影响其活力，可在4℃或冻结的状态下长期保存，耐一定浓度的变性剂，甚至煮沸亦不能使其完全丧失活性，因而在糖蛋白研究中应用也比较广泛。EndoH最近被用于糖蛋白组学中规模化鉴定糖基化位点，取得了一定的成功。EndoH最大的不足在于其狭窄的专一性，实际上EndoH只能作用于高甘露糖型和杂合型N-糖链。另外，留在糖基化位点处的GlcNAc在CID或PSD的条件下并不稳定，经常会脱落，从而起不到标记糖基化位点的作用。这都在很大程度上限制了它在糖蛋白鉴定中的应用。不过，可以利用其专一性和PNGaseF配合使用，阐明N-糖基化发生的类型。2.2.3生物质谱检测o-糖基化位点的应用对于O-糖蛋白来说，现在还没有一种能与N-糖蛋白研究中应用的PNGaseF相比的酶用以实现去糖基化/质量标记糖基化位点，所以O-糖基化位点的标记多采用化学法，其中报道较多的是β-消除反应法。该方法基于在碱性环境中Ser、Thr上的O-糖基团会发生β-消除形成1个不饱和的双键，这个双键可以被亲核试剂攻击发生加成反应，使Ser或Thr残基的质量相对其理论质量发生一个特定的变化，也就是使O-糖基化位点被质量标记，而且这种质量标记在PSD或CID的条件下是稳定的，从而可以通过串联质谱测序的方法得到糖基化位点的信息。β-消除反应很早就被广泛应用于糖蛋白的相关研究,反应条件也不断改进，比如极性非质子溶剂二甲基亚砜（DMSO）的加入起到了加快反应速度、减少蛋白质的降解以及增强某些难溶亲核试剂的溶解性的作用。加成反应中用的亲核试剂因实验目的的不同而多种多样，如Na2SO3、NaBH4、CH3SH、CH3NH2、CH3CH2NH2、NH4OH、CH3CH2SH，也有β-消除反应完后不进行加成反应直接分析Ser、Thr的消除反应产物2-氨基丙烯酸、2-氨基-2-丁烯酸的。近几年来β-消除-米氏加成反应与生物质谱技术结合用于O-糖基化位点测定方面已有不少报道[58,59,61,63,64,65,66]，大都是针对1个或几个糖蛋白或糖肽进行的方法学方面的研究。除了用于O-糖基化研究外，β-消除-米氏加成反应还更为广泛地用于蛋白质磷酸化富集、位点鉴定研究，相关报道远比O-糖基化研究要多，其中许多方法很值得在O-糖基化研究中借鉴。该方法的不足在于非糖基化或磷酸化的Ser、Thr残基的侧链羟基也可能发生β-消除，尤其是在较高的温度（>25℃）和较高的碱浓度下，这是该类方法在应用中应该注意的问题。2.2.4tfms去糖基化位点标记三氟甲基磺酸（trifluoromethananesulphonicacid,TFMS）法可以切除与肽链直接相连的单糖以外的所有糖基，留下的糖基则起到标记糖基化位点的作用。TFMS法去糖基化是基于这样的发现，即糖苷键对TFMS非常敏感，而肽键则在同样的条件下保持稳定，因而可以在保持蛋白质一级结构完整的同时切除糖链。该法反应温和，速度很快，在-10℃、90mmol/L苯酚存在的条件下，无水的TFMS可以在5min内切除辣根过氧化物酶同工酶C中8个N-糖基化位点的所有外围糖基，且切糖后60%的产物仍保持活性。该法对糖基化类型没有选择性，可以作用于所有类型的糖链，这一点对于O-糖基化位点的标记尤为重要。其他翻译后修饰基团如磷酸基、磺酸基、血红素及Ca2+、脂肪酰基以及二硫键在TFMS去糖基化过程中都不受影响。利用TFMS法标记确定糖基化位点已有不少相关报道，由于该法的温和性，这些报道多集中于蛋白质糖基化相关的构效关系研究。目前还未见TFMS法从蛋白质组学水平用于规模化糖蛋白鉴定/糖基化位点确定的相关报道，但作为一种广谱、高效、温和的去糖基化/质量标记糖基化位点的方法，TFMS法用于糖蛋白组学的前景还是很诱人的，相关方法学研究很值得开展。TFMS法存在的不足在于切糖操作要保持严格的无水条件，且糖链末端唾液酸的存在会影响反应的效率。有关TFMS法去糖基化已有很好的综述。鉴于蛋白质糖基化对于蛋白质组学操作从分离、富集、检测、酶解直到质谱分析及数据处理有着全程的影响，以及蛋白质糖基化发生的普遍性，因此即使不从翻译后修饰研究的角度考虑，上述去糖基化、消除糖基化不均一性的各种方法对于蛋白质组学中其他相关研究尤其是蛋白质表达谱的研究也有着巨大的现实意义。如血液中大量糖蛋白的存在势必影响血液中蛋白质的鉴定，这也是当前在国际人类蛋白质组组织（HUPO）领导下开展的人类血浆蛋白质组计划（HPPP）中遇到的问题，我们实验室正在开展这方面的相关研究，以期提高现有技术平台的效率。2.3新的糖化研究2.3.1关于蛋白糖基化位点标记方法蛋白质的O-GlcNAc修饰因其在信号转导中的可能作用正日益引起广泛的关注。在深入认识其发生发展的规律的基础上，相应的富集检测技术应运而生。Bertozzi等将N-叠氮乙酰氨基葡萄糖（GlcNAz）作为O-GlcNAc化相关酶的底物类似物加入到细胞的培养基中，利用细胞自身的代谢途径将GlcNAz连接到特定的糖基化位点，糖基上的叠氮基团可与连有不同标志物（探针，如生物素）的三芳基膦酯反应（Staudingerligation，施陶丁格连接），然后通过检测标志物从而确定修饰蛋白的存在。这种方法成功地用于标记、检测人jurkat细胞核蛋白和特定蛋白即核孔蛋白p62的O-GlcNAc化情况。此外，Bertozzi等还利用N-叠氮乙酰氨基半乳糖（GalNAz）通过细胞培养成功标记了黏蛋白类O-糖蛋白（mucin-typeglycoprotein）。这类方法为在蛋白质组水平进行O-糖基化研究提供了一种可能的思路，在一定程度上弥补了O-糖基化研究中缺少氨基酸的保守序列信息以及类似PNGaseF的适应范围广的酶等不足。该方法的不足在于标记必须借助于细胞/生物体自身的代谢途径，存在对糖基化过程的干扰，实验周期长，样品适用范围窄，而且由于内源性糖基化底物的竞争存在标记效率的问题，因而在反映生物体内糖基化的实际情况方面可能存在问题。与Bertozzi等的策略类似，Khidekel等在深入研究β-1,4半乳糖基转移酶（β-1,4-galactosyltransferase,GalT）的基础上，利用GalT对底物的耐受性，将1个带有酮基的UDP-半乳糖特异地连接到O-GlcNAc上，然后利用酮基的反应性与生物素连接，进而可以通过链亲和素-辣根过氧化物酶化学发光检测或通过抗生物素蛋白富集。与Bertozzi等的策略不同，Khidekel等采用了基因工程改造的GalT(Y289LGalT）进行体外标记，从而避免了对代谢途径的干扰，使实验结果更接近于O-GlcNAc发生的真实情况，而且由于不依赖生物体自身代谢途径，大大地扩展了方法的适用范围。更为重要的是通过对GalT的改造，在不影响专一性的前提下极大地提高了酶的活性，可以使标记反应迅速完全地进行，因而更适于蛋白质组学高灵敏、通量化分析的要求。Khidekel等应用这种方法从鼠脑中鉴定了25个O-GlcNAc化蛋白。显然将这种方法与上述糖基化位点标记方法结合可用于糖基化位点的确定。随着糖基化相关研究的深入开展，对于蛋白质糖基化发生发展规律的认识将不断得到深化，上述基于糖基化分子、细胞生物学机制的分析方法有着广阔的发展空间。2.3.2膜质裂解检测虽然上述糖基化位点标记的方法在应用中都取得了不同程度的成功，但是由于PSD、CID等裂解方式本身一些固有的弱点，得到一幅好的MSMS图谱并据此进行糖蛋白的鉴定尤其是糖基化位点的确定在很多情况下仍很困难。与通常的蛋白质组学研究相比，蛋白质组学水平的翻译后修饰研究对质谱技术提出了更高的要求，翻译后修饰研究所面临困难的根本解决应有赖于对多肽气相裂解规律更深入的理解以及在此基础上新的裂解方式、新仪器、新试剂的开发应用。随着利用MSMS数据及蛋白质、DNA数据库进行蛋白质鉴定的相关计算机软件的开发，多年来一直进行的多肽气相裂解规律研究日益引起关注。近年来由Wysocki等提出的移动质子模型获得了较为广泛的认同。该理论认为在CID或PSD条件下，大多数质子化的多肽在裂解时需要1个质子在裂解位点处促进裂解，如果肽链中存在质子亲和力强的氨基酸残基如精氨酸、赖氨酸，则需要更高的能量使质子摆脱束缚，使质子移动到肽链的不同位置并促进该位置肽键的裂解，产生y离子和b离子。这一理论正在得到越来越多的实验数据的支持。移动质子模型最具代表性的应用是化学辅助裂解（chemicallyassistantedfragmentation,CAF）试剂的开发。CAF试剂通过在多肽的N-端连接1个磺酸基使该多肽即使在MALDI-PSD的条件下离子化时也可以保证有1个可以自由移动的质子辅助产生丰富的裂解，而且由于N端电负性磺酸基的存在抑制了包含N端的b离子在正离子检测模式下的信号，从而只产生y离子，大大简化了数据的解析。CAF试剂与在PSD或CID条件下能稳定存在的质量标记相结合用于糖基化、磷酸化等翻译后修饰位点的确定有很好的应用前景。CAF试剂的最大不足在于磺酸基的引入使灵敏度在通常的正离子检测模式下降低至约1/10。此外，依据移动质子模型，糖基在PSD或CID条件下的不稳定被归因于可移动质子的影响。据此，Czeszak等在糖肽的N端标记1个带正电荷的基团[三（2,4,6-三甲氧基苯）乙酰膦，TMPP-Ac]，在MALDI-PSD条件下使糖肽的离子化不必借助于质子的加入，从而消除了可移动质子对糖基的催化裂解，经过不同于移动质子模型的裂解途径（主要产生a离子），使多肽在不丢失糖基的同时产生广泛的主链裂解，从而通过MSMS图谱确定了糖基化位点。采用这种正电基团标记的方法，Czeszak等成功地确定了来自黏液素蛋白的多肽上多达3个的O-糖基化位点。2.3.3蛋白质组学在翻译后修饰中的应用CID和PSD是目前应用最为广泛的MSMS裂解方式，在规模化多肽测序/蛋白质鉴定中取得了巨大的成功。但是随着蛋白质组学研究领域的拓展，这2种裂解方式也暴