粉拟青霉菌的复壮技术及其应用效应研究

粉拟青霉菌的复壮技术及其应用效应研究

粉细胞菌的分类是半知菌亚门子带丝菌素、杆菌素和绿霉科的特生菌。其菌落粉白色,营养菌丝平滑透明,直径0.7～2.5μm;分生孢子梗从基质菌丝上长出,散生,大小1～2×300μm,具隔膜,平滑透明,有1～5个轮生小梗,小梗瓶形,基部膨大,直径约为0.5μm;分生孢子瓶梗形,近无色,产生于分生孢子梗上;大小为2.0～3.7μm×1.5～3.5μm。常侵染鳞翅目、鞘翅目、同翅目等多种昆虫,致虫体僵死,在欧美各国颇受重视。该菌对松纵坑切梢小蠹(Tomicuspiniperda)有很好的致病性。但由于粉拟青霉菌的孢子是多核的,其异核体菌株的性状,可随环境因素的变化而发生变异。经过人工多代繁殖、转管传代后会引起抗原结构发生突变,导致原始菌株退化,孢子活性减弱,毒力降低,影响防治效果。因此,掌握粉拟青霉菌菌株的毒力复壮技术,检验应用复壮后的粉拟青霉菌防治松纵坑切梢小蠹的效应为本项研究之目的。1材料和方法1.1材料表面参试用的粉拟青霉菌菌种,于1998年8月从沾益试验林区采集到的被粉拟青霉菌感病死亡的松纵坑切梢小蠹成虫虫体上分离而得。1.2方法(1)分生孢子分离纯化将从试验林区采集到的被粉拟青霉菌感病死亡的松纵坑切梢小蠹成虫,用75%乙醇和1%升汞水溶液进行虫体表面消毒后,置于无菌试管中于常温下保存。待虫体表面长出粉白色分生孢子后,用孢子震落平板稀释法进行分离纯化。单菌落挑取后用马丁培养基进行接种培养,3～5天后,待试管斜面长出旺盛的菌丝体时,用紫外灯光距20cm照射20min进行菌种诱变和选育,待长出丰富的白色或粉红色的孢子后,选择孢子长势丰满的菌体用来作菌种复接,以此反复多次筛选获得复壮用的最佳菌株。复接后5～7天,将生长旺盛的菌落作为复壮用菌种。(2)复壮菌株回接培养利用改变培养基成分,调节培养基中碳源、氮源及复合营养物质的比例,以实现粉拟青霉菌菌株毒力的复壮。采用定向培养方法,连续3次用Pf-Ⅱ号培养基(Pf-I+0.2%物质A+0.2%物质B+2%复合营养物质)对已经过分离、纯化、筛选后得到的粉拟青霉菌复壮用菌株进行回接培养,以获得毒力复壮菌株。用复壮后的粉拟青霉菌菌株制成菌悬液待用。Pf-Ⅱ号培养基配方作为项目成果另报。2粉碳反应产物的毒力试验2.1复壮前后的芽孢杆菌的致死率及活力用复壮后的粉拟青霉菌菌悬液,在室内常温下对松纵坑切梢小蠹成虫进行毒力测试,并与复壮前菌株毒力测试数据进行比较。测试结果见表1和表2。从表1得出,粉拟青霉菌菌株复壮前的孢子悬液对松纵坑切梢小蠹成虫的平均致死率为48.8%,其菌株活力较低。从表2得出,用经复壮后的粉拟青霉菌菌株制成的孢子悬液对松纵坑切梢小蠹成虫的平均致死率达88.5%,比复壮前提高了39.7%。表明经毒力复壮后的粉拟青霉菌菌株,对松纵坑切梢小蠹的防治效果显著。2.2粉拟青霉菌对松纵坑切梢小蚤成虫的感病死亡率调查测试时间为2002年1月至2003年12月。在本项目研究基地的沾益县西平镇文家坟、火石梁子受松纵坑切梢小蠹蠹害的林区,分别设置12块测试林地,每块测试林地的面积为3.3hm2,其受蠹害的程度为轻度到中度,其间逐月进行药效和林间用菌粉最佳时间的测试。试验用的粉拟青霉菌菌粉,是经用复壮后的菌株生产的菌粉。每克含孢量为108亿个,其中活孢率>90%,悬浮率>70%,水分<5%,细度300目,pH值5.5～6.5。每0.07公顷用量1kg。测试结果见图1、图2、图3。从图1得出,5～25℃的林间温度对粉拟青霉菌感染松纵坑切梢小蠹成虫造成其感病死亡的影响不明显。虽此,以15℃～20℃为粉拟青霉菌感染致死松纵坑切梢小蠹成虫的适宜林间温度。从图2、图3得出,进行粉拟青霉菌林间毒力测试的林区,其1月中旬的林间平均相对湿度为81.0%,此间松纵坑切梢小蠹成虫蛀梢的感病死亡率为71.5%。2月上旬至6月中旬,随着林间相对湿度的减低,松纵坑切梢小蠹成虫蛀梢的感病死亡率亦随之下降,从1月中旬的71.5%降至6月中旬的55.5%。2月上旬至5月下旬,林间平均相对湿度为61%～65%,此时期松纵坑切梢小蠹成虫蛀梢的感病死亡率仅为12.5%～21.5%。6月下旬至10月下旬,林间平均相对湿度逐渐从80%增至90%,而此间的松纵坑切梢小蠹成虫蛀梢的感病死亡率从70.5%增至77.5%。11月上旬,林间平均相对湿度从74%降至60%,而此时的松纵坑切梢小蠹成虫蛀梢的感病死亡率从70.5%降至14.2%。以上试验数据表明,林间粉拟青霉菌对松纵坑切梢小蠹成虫的感病死亡效果与林间相对湿度有着正相关关系,其最适的相对湿度为90%～95%,下限不能低于80%。根据云南的气象情况和松纵坑切梢小蠹的种群变动规律,1月中旬、6月下旬至10月下旬两个时段均为林间用粉拟青霉菌喷粉防治松纵坑切梢小蠹成虫的适宜期,此间的7月上旬至10月中旬是其喷粉防治的最佳时期。3菌粉的用量2004年1月下旬,7月中旬,8月中旬,9月中旬,10月中旬对本项目研究基地沾益县文家坟、火石梁子的150hm2蠹害林,用经复壮后的粉拟青霉菌生产的菌粉进行松纵坑切梢小蠹的全面防治。其菌粉的用量为1kg/0.07hm2,每克菌粉含孢量108亿个。防治效果见表3。从表3得出,在沾益县文家坟、火石梁子两蠹害林区施用经复壮后的粉拟青霉菌粉剂对其松纵坑切梢小蠹进行防治后有虫株率从防治前的32.9%降到4.6%,受害株减退率为86.1%。表明对受蠹害林区施用经过复壮后的粉拟青霉菌菌粉防治松纵坑切梢小蠹的效果显著。4粉拟青霉菌菌体的培养在虫生真菌与其寄生昆虫的共同适应过程中,虫生真菌表现出对寄生昆虫的相对适应性。其独特的生物学特性、奇特的扩散形式、可靠的宿存方式、多变的致病机制以及有效的活体营养等均反映出这种适应性。在林间自然状况下,粉拟青霉菌寄生于松纵坑切梢小蠹的现象就体现了这种适应性。然而,人为利用虫生真菌的寄生特性来防治有害昆虫时,每生产一批菌种均需要进行分离培养,菌种因往返多次的转接和施用,会使菌体原来在自然界中相对稳定的生物学特性发生改变,导致原始菌株退化,致病性减弱。所以在利用虫生真菌防治有害昆虫时为保持真菌相对有效和稳定的致病性,其菌体的培养条件和培养方式较为关键。本项研究着眼于探寻培养复壮粉拟青霉菌的有效培养基配方,以恢复并保持其菌体相对有效而稳定的致病性。经不断的探索,获得了粉拟青霉菌毒力复壮用的Pf-Ⅱ号培养基。试验结果表明,用此培