益智宁神颗粒治疗儿童注意缺陷多动障碍的神经机制研究

益智宁神颗粒治疗儿童注意缺陷多动障碍的神经机制研究

儿童容易运动的缺陷（advd）被称为儿童障碍。这是学龄儿童中发病率高的心理障碍疾病，可能会严重影响儿童的身心健康和学习能力。临床中笔者采用益肾填精、宁神益智之益智宁神颗粒治疗本病取得了满意疗效。近来研究发现,本病的发生与患儿血清去甲肾上腺素(NE)功能不足,多巴胺(DA)与NE失衡,引起单胺类神经递质的代谢紊乱密切相关。本实验以目前国际上使用最为广泛的ADHD动物模型———自发性高血压大鼠(SHR)为研究对象,通过观察大鼠脑组织DA、NE含量的变化,初步探讨益智宁神颗粒治疗ADHD的神经生化机制。1实验材料1.1实验动物1.2siga公司NE、DA、3-甲氧-4-羟苯乙二醇(MHPC)、高香草(HVA)均为Sigma公司产品。高氯酸(分析纯)、辛烷磺酸钠(色谱级)、乙二胺四乙酸(EDTA)(分析纯)、磷酸二氢钾(分析纯)、磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱级)、水(超纯水)均由天津中医药大学实验中心提供。1.3检测仪器和设备KQ-250E型超声仪,为昆山市超声仪器有限公司产品。Agilent1100高效液相色谱仪,为美国安捷伦科技公司产品。ANTECLEYDENDECADEⅡ电化学检测器,为美国AntecLeyden公司产品。梅特勒-托利多AX205分析天平,为瑞士梅特勒-托利多公司产品。XW-80A型微型涡旋混匀器,为上海沪西分析仪器厂产品。Beckman高速离心机,为美国贝克曼库尔特公司产品。Gilson移液器,为法国吉尔森公司产品。超纯水系统Millipore,为美国密理博公司产品。1.4试验样本的配制1)益智宁神颗粒:由紫河车、熟地黄、远志、泽泻、石菖蒲、黄连等组成,由天阴制药有限公司提供。按高、中、低给药剂量以蒸馏水配制(每次灌胃时当场配置),配成生药含量分别为3.75、2.8125、1.875kg/L。2)利他林片:为苏州医药集团有限公司产品,每次灌胃时当场配制,所配悬浊液浓度为0.625g/L。3)静灵口服液:为吉林东方人制药有限公司产品,可直接灌胃。2学习方法2.1智宁神颗粒量的模型将48只SHR大鼠随机分为6组:益智宁神颗粒高、中、低剂量组,静灵口服液组,利他林组,模型组。将8只同龄Wistar大鼠设为正常对照组。2.2林分和剂量选择1)益智宁神颗粒高、中、低剂量组:灌服益智宁神颗粒冲剂,剂量分别为37.5、28.125、18.75g/kg,1次/d,持续7d。2)利他林组:灌服利他林6.25mg/kg,1次/d,持续7d。3)静灵口服液组:灌服静灵口服液12.5mL/kg,1次/d,持续7d。4)正常对照组、模型组:蒸馏水10mL/kg,1次/d,持续7d。2.3检测方法应用高效液相—电化学法进行检测2.3.2养老器检测参数流动相比例:水相∶甲醇∶乙腈=78∶19∶3,色谱柱型号:WatersRP-C18柱(3.9mm×150mm,5μm),流速:0.8mL/min,柱温:35℃,检测器参数:Range:200nA;Ec:+0.7V;Filt:0.1Hz;电极:银-氯化银(Ag-AgCl)电极。因流动相中使用了离子对试剂,所以进样分析前以0.8mL/min的流速用流动相平衡色谱柱约2h后再进样,保留时间稳定且峰形良好。2.3.3标准品溶液的配制分别精密称取NE、DA、HVA各1.0mg,分别置于10mL容量瓶中,加超纯水至刻度,作为标准品储备液,0.1g/L。分别取上述3种标准品储备液适量转移至10mL容量瓶中,再用超纯水稀释至刻度,稀释成浓度分别为8、20、40、60、200、500μg/L的NE对照品溶液,浓度分别为20、40、60、200、500、1000mg/L的DA对照品溶液,浓度分别为20、40、60、200、500、1000μg/L的HVA对照品溶液,用0.45μm的微孔滤膜过滤,取滤液备用。2.3.4两个生产线性的回归分析取上述一系列稀释好的标准液,各个浓度均精密吸取10μL进样分析。以NE、DA、HVA的浓度C(mg/L)为横坐标,峰面积A为纵坐标,绘制标准曲线。NE的线性回归方程为A=3.0810C-12.7600,R^2=0.9984,NE在8~500μg/L范围内呈良好的线性关系;DA的线性回归方程为A=2.1895C-2.3607,R^2=0.9997,DA在20~1000μg/L范围内呈良好的线性关系;HVA的线性回归方程为A=2.5984C-1.9985,r=0.9957,HVA在20~1000μg/L范围内呈良好的线性关系。2.3.5进样稳定性测定取适当浓度的NE、HVA、DA标准品溶液,进样10μL/次,分别连续进样6次,测定NE、HVA、DA的峰面积,求算精密度,结果峰面积(RSD)分别为1.17%、0.90%、1.37%。2.3.6大脑皮质的制备大鼠断头处死后迅速取脑,在置于冰浴中且垫有潮湿滤纸的玻璃器皿上迅速剥离大脑皮质和小脑,将剩余部分称质量后,放入置于冰浴中的砚钵中,加入4mL高氯酸,匀浆2min。所得匀浆液用高速冰冻离心机12000r/min离心15min,吸取上清液10μL,进样分析。2.4统计处理实验数据用均数±标准差表示,统计方法采用SPSS11.0软件包处理,进行单因素方差分析。3智宁神颗粒对大鼠体内da、ne含量的影响结果见表1。统计结果表明:与正常对照组比较,模型组大鼠脑组织中DA、NE含量显著增高,HVA无明显差异,提示DA、NE两者含量的显著增高可能是ADHD发病的神经生化机制。益智宁神颗粒高剂量组大鼠脑组织中DA、NE含量显著降低;益智宁神颗粒中、低剂量,利他林及静灵口服液组,对大鼠脑组织中DA、NE含量无显著影响。4adhd发病机制的研究ADHD是学龄时期高发的一种精神行为障碍性疾患,属中医“躁动”、“失聪”、“健忘”等范畴。经过多年的临床实践,笔者认为本病病机为“肾精亏虚,阴阳失调,阳动有余,阴静不足,脏腑功能失常,致脑髓失养”,据此确立了“益肾填精,宁神益智”治疗大法,研制出“益智宁神颗粒”,重在应用既可补肾气又可滋肾阴的血肉有情之品,起到肾阴肾阳并重,协调阴阳的目的。方中紫河车,入肾经,养血益精。熟地黄,入肝、肾二经,滋阴补血。两者共为君药,益肾填精,补脑益智,以达治动之本。石菖蒲开窍、豁痰、理气、活血,远志安神益智、解郁,两药共为臣药,宁心柔肝,开窍定志,以达治动之标。泽泻,甘寒,有泻热之效,为“反佐”之意,以免温燥太过,并可引诸药归于肾。黄连,苦寒,泻心肝之火热,交通心肾,为使药。诸药合用,共奏益肾、填精益智,宁心安神,柔肝清火之功,最终平衡阴阳,协调脏腑功能,使精气充足,脑神得养,智力提高,情绪稳定,学习效率提高。由于ADHD在学龄期儿童中患病率较高,因此20世纪90年代在国际上掀起了对ADHD的研究高潮,对于神经生化机制的研究也逐渐增多。HalperinJM曾指出ADHD是与儿茶酚胺类神经递质NE功能异常相关的病症,其异常变化与患儿临床表现特征有密切联系。GirosB等利用基因敲除技术,敲除DAT基因,来研究DAT与ADHD的关系,发现DAT敲除小鼠具有ADHD活动过度、认知缺陷,并且活动过度的现象可被利他林等精神兴奋剂所改变等,利他林可以通过抑制DAT而间接增强DA功能,从而发挥治疗作用,故提出DA功能异常可能是ADHD的发病基础。由于DA可促进运动、攻击行为和性行为,其含量异常增加可导致过度的运动和攻击性行为,类似ADHD的活动过多、冲动等行为;但同时NE增加则能促进良好注意和有选择注意、条件反射早、出现焦虑早、过度抑制、内向等,其含量增加的表现似乎与ADHD注意力不集中的临床表现不相符,所以以上文献应用单一神经递质假说去解释ADHD的病理机制,难免不全面。本实验中,大鼠脑组织中儿茶酚胺类神经递质及其代谢产物DA、NHVA含量异常,主要表现为模型组大鼠脑组织中DA、NE含量显著多于正常对照组,虽与上述文献报道含量降低不相一致,但支持2001年JonesMD对活动过度的SNAP-25的突变缺失小鼠进行研究,发现儿茶酚胺类神经递质的改变与活动过度密切关系,认为脑组织中纹状体的DA、NE均增高,是造成多动的主要原因。此种活动过度的SNAP-25突变缺失小鼠是1996年WilsonMC等通过对小鼠神经系统进行X线照射来进行造模,其中Cm+/-杂合子小鼠表现出多动症的核心症状:自发性活动过度、神经发育落后等,小剂量右旋安非他明可有效降低多动,但利他林却呈剂量依赖性地增加模型组小鼠的运动水平。KiehlR测得ADHD患儿血浆DA、NE也均高于正常对照组。故对于ADHD发病机制的探讨,需将本实验结果,同时与上述DA、NE两种神经递质功能以及ADHD临床表现相结合,进而可以得出这样的结论:脑组织中DA、NE含量均显著增加,而且两者平衡失调,即相对于DA含量较高,NE处于相对低下的水平,是ADHD发病的神经生化机制。正常情况下,儿茶酚胺类神经递质相互作用处于一种平衡状态,任一递质的含量增高或降低都会导致功能失调,所以上述诸多文献报道并非相矛盾,而是不够全面。治疗组中,中药高剂量组大鼠脑组织中DA、NE含量的降低,与模型组存在显著差异,说明高剂量中药能明显降低脑组织中DA、NE含量,纠正儿茶酚胺类神经递质的不平衡状态;利他林组只是NE含量有所降低,统计学无意义,可能与其治疗机制是促进突触间隙NE的释放并阻止其再摄取,表现出的NE功能增强,注意力集中,对于DA含量以及两者平衡的恢复作用不明显。选用健康雄性SHR大鼠48只,同龄Wistar大鼠8只,体质量(50±10)g,购自北京维通利华实验技术有限公司。自然光照,自由进食,分笼饲养,饲料为固定配方的大鼠饲料,适应性喂养3d后开始实验。2.3.1标品溶液的配制1)全部实验需用超纯水,除Sigma公司提供标准品外,所有化学试剂均须优质纯或分析纯。2)神经递质标准品储备液配制:精确称量NE