茅莓根保护多巴胺能神经元作用的甜叶苷r

茅莓根保护多巴胺能神经元作用的甜叶苷r

草莓是蔷薇科植物的一种流行药物，具有清热解毒、肿胀、镇痛、止血活血等功效。民间发现茅莓根的酒浸剂可减轻帕金森病(PD)患者的症状。本文为证实茅莓的这种效应,利用PD小鼠模型,从其粗提物和精提物中逐步分离纯化筛选出一种具有抗PD的有效成分。经多种色谱技术和红外光、谱紫外光谱、超导核磁共振等技术鉴定该有效成分为甜叶苷R1,并检测出甜叶苷R1具有保护多巴胺(DA)能神经元作用。1材料和方法1.1细胞培养和免疫12周龄C57BL/6J雄性小鼠和孕14d的SD大鼠由中山大学药学院实验动物中心提供。原植物经第二军医大学药学院郑汉臣教授鉴定为茅莓RubusparvifollusL.的干燥根。DMEM/F12粉、胎牛血清、青/链霉素均为Gibco产品;其余细胞培养试剂以及MPTP和MPP+等均购自Sigma。在细胞实验中,甜叶苷R1用DMSO溶解,培养液稀释,DMSO终浓度为0.1%。特异性抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体,购自Chemicon;驴抗小鼠(cy3标记)的荧光二抗购自Jackson公司。1.2模型小鼠精提物和的分离纯化取茅莓根的干燥粉末10kg,95%乙醇浸泡提取多次后,提取液回收乙醇(粗提物)。残渣用石油醚去除脂溶性成分(精提物Ⅰ)后悬浮于水中,用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯得到棕色粉末状物质(精提物Ⅱ),不溶于乙酸乙酯的部分用甲醇萃取,回收甲醇后得淡棕色物质(精提物Ⅲ)。用MPTP小鼠模型筛选测试精提物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,发现精提物Ⅱ具有升高MPTP模型鼠纹状体DA的作用,精提物Ⅰ、Ⅲ作用不明显。将精提物Ⅱ滴加于硅胶中,晾干。经反复硅胶析柱层析,用石油醚、乙酸乙酯梯度洗脱等方法,进一步分离出不同组分。用MPP+处理原代培养大鼠中脑DA能神经元为模型进行筛选,阳性者进一步纯化,最后分离出一种白色针状结晶性成分(化合物Ⅰ)。该成分易溶于甲醇、乙醇、碱性水溶液、乙酸乙酯、丙酮等溶剂,微溶于水,不溶于氯仿、石油醚、乙醚、二氯甲烷等溶剂。该提取方法得率约0.1%,该成分遇香蓝醛浓硫酸液加热变蓝色。1.3粗提物的注射C57BL/6J雄性小鼠分为对照组、模型组和茅莓粗提物组。模型组和粗提物组用MPTP腹腔注射,20mg/kg,2次/d,连续注射4d。对照组给予等量生理盐水注射。注射后第4d,粗提物组给予茅莓粗提物灌胃,剂量分别为3.2、16mg/kg,2次/d,连续18d。对照组和模型组用与粗提物同体积生理盐水。第19d取脑,分离出双侧纹状体,称重。用荧光法测定并计算出纹状体DA含量。1.4小鼠mptp的注射在粗提物的研究结果上,提取出三个精提物组分(精提物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。分别给模型组和精提物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠MPTP腹腔注射,剂量同前。MPTP注射第5d,给药组分别给予精提物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ灌胃,剂量分别为15、10、2mg/kg,2次/d,连续灌胃18d。第19d取纹状体测DA含量。1.5培养基和阿糖胞苷取孕14d的胎鼠,按文献方法进行操作。将细胞悬液以5×105个/ml接种到预先用50μg/ml多聚赖氨酸包被的24孔板内。培养基为含青/链霉素和15%胎牛血清的DMEM/F12。在37℃、5%CO2孵箱内培养,24h后在培养液内加入10μmol/L阿糖胞苷抑制胶质细胞生长。每3d换一半培养液。1.6th免疫组化染色细胞培养的第5d,以1、10、100、300μmol/L的甜叶苷R1预孵细胞。2h后在模型组和给药组中加入10μmol/L的MPP+。48h后参照文献进行TH免疫组化荧光染色。将胞体饱满,至少有一个突触,突触长度是胞体直径两倍的细胞定义为存活细胞。保护作用以存活率表示:存活率=各处理组存活细胞总数对照组存活细胞总数×100%。1.7统计处理数据均以ˉx±s表示,用SPSS11.0软件进行One-WayANOVA统计分析,P<0.05为有统计学意义。2化合物的结构及用量2.1结构鉴定从精提物Ⅱ提取分离出的化合物Ⅰ白色针状结晶,mp247.4～248.8℃,[α]+20.0D=0.036°。可溶于甲醇和乙醇,微溶于乙酸乙酯,不溶于石油醚。FABMS(m/z):519,501,473,455,437,409,391,375,279,277,255,239,201,185,159,131,119,93,57。元素分析实测值(计算值):C60.25%(60.30%),H8.40%(8.44%)。1H-NMR(DMSO-d6):δ1.98(4.5Hz,12.5Hz),3.63(dd,10Hz,4.5Hz),3.73(d,10Hz),1.62,1.73(13Hz,3.5Hz),1.28(m),1.85(8Hz,12.5Hz),2.03(9.5Hz,3.5Hz),5.33(dd,13.5Hz,3.5Hz),0.98(4Hz,11.5Hz),1.14,1.62(4Hz,9Hz),2.52,1.35(m),1.26(8.8Hz),1.65(m),1.11(s),0.76(s),1.04,0.77,1.34(s),0.93(d,6.5Hz),1.20(s),5.32(d,8Hz),3.28(dd,13.5Hz,3.5Hz),3.38(dd,2.5Hz,12Hz),3.34,3.345(d,3.5Hz),3.67(12Hz,4.5Hz),3.79(12Hz,2Hz)。13C-NMR(DMSO-d6):48.3(C-1),69.3(C-2),81(C-3),55.1(C-4),52.7(C-5),38.2(C-6),33.7(C-7),41.3(C-8),48.8(C-9),39.2(C-10),24.8(C-11),129.3(C-12),139.7(C-13),42.7(C-14),29.6(C-15),21.8(C-16),49.3(C-17),54.9(C-18),73.6(C-19),42.9(C-20),27.2(C-21),26.5(C-22),180.7(C-23),12.8(C-24),17.7(C-25),17.5(C-26),24.7(C-27),178.5(C-28),16.6(C-29),27.1(C-30),95.7(C-1′),73.8(C-2′),78.3(C-3′),71.2(C-4′),78.5(C-5′),62.5(C-6′)。IR(KBr)cm-1:3414.69,2928.52,1727.35,1458.25,1390.07,1260.38,1075.97,896.61,771.44,680.19。UV(CH3OH)λmax:213nm,Abs2.8395。最终确定化合物Ⅰ为甜叶苷R1,其分子式为C36H56O12·2H2O,分子量为716。与文献报道一致。2.2茅莓粗提物对MPTP降低小鼠纹状体DA作用的影响给予茅莓粗提物处理的PD小鼠能拮抗MPTP导致的小鼠纹状体DA含量的下降。结果见表1。2.3茅莓精提物对MPTP降低小鼠纹状体DA作用的影响给予茅莓精提物Ⅱ处理的PD小鼠能拮抗MPTP导致的小鼠纹状体DA含量的下降。精提物Ⅰ、Ⅲ对DA含量无明显影响。结果见表2。2.4甜叶苷R1在MPP+诱导体外培养的大鼠中脑腹侧DA能神经元凋亡中的保护作用TH阳性细胞形态改变见图1(A)。相对于对照组,给予MPP+作用48h后,细胞突触数目和长度明显减少,部分呈串珠样膨胀。MPP+处理前给予100μmol/L甜叶苷R1预孵,上述形态改变不明显,比较接近正常TH阳性细胞形态。对存活细胞计数后,图1(B),发现用MPP+处理后TH阳性细胞存活率只有正常对照组的57.8%,用甜叶苷R1预处理后,100μmol/L组甜叶苷R1与MPP+组有明显的统计学差异,存活率为80.2%。提示在一定剂量范围内,甜叶苷R1可减少MPP+对DA能神经元的毒性效应。3精提物对小鼠da含量的影响DA能神经元凋亡及纹状体DA含量下降是PD发病机制之一。甜叶苷R1最早是从蔷薇科植物甜茶中分离出来,国内已有从茅莓根中提取出甜叶苷R1的报道,但尚未见甜叶苷R1具有DA能神经元保护作用和用于PD治疗的研究。在茅莓粗提物的研究上观察到其可拮抗MPTP导致的小鼠纹状体DA含量降低。再从粗提物继续进行层析分离和鉴定,取得三个组分:精提物Ⅰ溶于水;精提物Ⅱ难溶于水及有机溶剂;精提物Ⅲ量稀少,可溶于有机溶剂。实验结果显示,茅莓精提物Ⅰ和Ⅲ对MPTP处理小鼠纹状体DA含量无明显升高作用,而精提物Ⅱ能明显升高MPTP处理小鼠纹状体DA含量,提示精提物Ⅱ