蜂房提取物的抑菌活性研究

蜂房提取物的抑菌活性研究

现代虫象生态理论认为，虫象的发生是正常口腔菌组的平衡造成的，并将生态生理组合转变为病理化合物。根据该理论,龋病预防的途径是通过调节口腔生态平衡,恢复口腔生态的生理性组合。因此,寻找安全而又有效的生态调节制剂已成为龋病防治研究的重点。天然药物包括植物药、动物药和矿物药等,其来源丰富,取材方便,用法简单,疗效显著且副作用甚微,是重要的生态调节药物。黄正蔚等研究发现,五倍子和蜂房的抑龋能力较强,即使在不影响各实验菌株生长的较低浓度下也可有效抑制产酸;在生物膜模型中随着蜂房提取物溶液的加入,显著减少了变形链球菌在羟磷灰石片上粘附的量,通过扫描电镜的观察也发现出胞外基质明显减少,提示蜂房溶液的加入可能对菌斑的致龋化转变有一定的抑制作用。但是目前的研究都只停留于使用蜂房的粗提物,如丙酮提取物,醇提物,剂型粗糙,对蜂房的抗龋性能活性成分还未见具体报道,该实验拟采用现代化的分离方法,对蜂房抑龋有效成分进行追踪。1材料和方法1.1蜂房及蜂房组分的分离称取蜂房10kg,以95%乙醇浸渍后渗漉,得到95%乙醇渗漉液和残渣。将95%乙醇渗漉液浓缩至稠膏,加水以乙酸乙酯萃取,再将萃取液用硅胶柱层析分离,得到3个组分,分别为蜂房组分1(NVE1),蜂房组分2(NVE2),蜂房组分3(NVE3)。将95%乙醇渗漉液的残渣继续以56%乙醇渗漉,浓缩,得到蜂房组分4(NVE41)。蜂房提取物1、2和3中含有较多的甾醇类化合物,其中蜂房1内有可分离鉴定到α-谷甾醇,蜂房3内有可分离鉴定到α-胡萝卜甙。1.2菌株和培养基变形链球菌S.mutansATCC25175,血链球菌S.sanguisATCC10556,唾液链球菌S.salivariusSS196,内氏放线菌A.naeslundirWVU627,粘性放线菌A.viscosusATCC19246,乳酸杆菌L.rhamnosusAC413由教育部口腔生物医学工程重点实验室提供。将复苏48h的菌种接种于TPY液体培养基中,80%N2,20%CO2,37℃下厌氧培养18h,涂片检查为纯培养后将菌液在4℃下3000r/min离心15min,收集细菌,无菌生理盐水洗菌2次,并用无菌生理盐水调整,使菌悬液540nm处吸光度A=1.0。1.3最低药物浓度测定使用96孔板法测定药物对6种细菌的MICO将蜂房精提物及各不同组分按对倍稀释法溶于含1%葡萄糖的TPY液体培养基中,使其生药终浓度达到32.000、16.000、8.000和4.000mg/ml。按菌液与TPY液体培养基1∶1(v/v)比例分别接种细菌悬液于96孔板中,80%N2,20%CO2,37℃下厌氧培养48h。以肉眼观察无细菌生长的最低药物浓度为其MIC值。结果见表1。1.4生长曲线的绘制使用活菌计数法测量蜂房精提物及各组分对变形链球菌生长曲线的影响。将蜂房精提物及各组分配制成为含有蜂房药物的TPY液体培养基,浓度为8mg/ml。将复苏48h的菌种接种于TPY液体培养基中,80%N2,20%CO2,37℃下厌氧培养18h,涂片检查纯培养后使用比浊仪,调整菌悬液最终浓度达到5×107CFU/ml,按菌悬液与TPY液体培养基1∶10(v/v)比例将细菌接种于含有蜂房药物的TPY液体培养基中,80%N2,20%CO2,37℃下厌氧培养。分别于培养5、10、30min及1、2、4、6、20和24h提取菌液,PBS缓冲液梯度稀释后取5μl菌液接种于TPY固体培养基上,80%N2,20CO2,37℃下厌氧培养48h后计算活菌数,用菌落形成单位数(CFU/ml)的对数(log)为纵坐标,时间为横坐标,作图绘制生长曲线。活菌计数减少99.9%即差异>3logCFU/ml者视为有杀菌作用,活菌计数下降1～3logCFU/ml者视为有抑菌作用。2结果2.1蜂窝提取物和各种组成对细菌生长的影响从表1可以看出,蜂房提取物组分1和组分2对实验菌株的抑制作用较蜂房提取组分3、组分4更强。2.2蜂窝提取物和各种组成部分对变形链生长曲线的影响从图1可以看到蜂房提取物组分1、2和3均能在较短时间抑制变形链球菌的生长,其中蜂房提取物组分3对于细菌生长的抑制作用最强。3蜂房提取物对变形链球菌生长曲线的影响研究表明,许多天然药物都具有较强的防龋作用,如茶多酚等能抑制口腔细菌的产糖与产酸能力。蜂房为胡蜂科昆虫大黄蜂或同属近缘昆虫的巢。具有祛风、攻毒和杀虫的功效,蜂房药用历史悠久,早在两千多年前的《神农本草经》就已有记载。国内研究表明蜂房的抑龋能力较强,即使在不影响各实验菌株生长的较低浓度下也可有效抑制产酸、产胞外多糖及早期粘附等致龋毒力因子,在生物膜模型中随着蜂房提取物溶液的加入,显著减少了变形链球菌在羟磷灰石片上粘附的量,通过扫描电镜的观察也发现出胞外基质明显减少,提示蜂房溶液的加入可能对菌斑的致龋化转变有一定的抑制作用。该实验从蜂房中分离得到4个组分,其中3个组分有甾醇类化合物,并首次在蜂房中分离鉴定到α-谷甾醇和α-胡萝卜甙,由于它们有较强的杀菌能力,推测主要是这些甾醇类化合物的作用。通过观测蜂房各提取物对变形链球菌生长曲线的影响发现,蜂房提取物组分1,2,3均有明显的杀菌作用,其中组分3在10min时就可杀灭变形链球菌,而蜂房提取物组分1,3在30min时也能杀灭变形链球菌。由此推测蜂房提取物为浓度依赖性杀菌药,能在较短接触时间内杀灭变形链球菌。同时提示蜂房提取物可能具有抗生素后效应,即细菌与抗生素或抗菌药物,经短时间接触,将残留抗生素清除后,细菌生长仍受抑制的生物现象。这也表明,可将蜂房提取物用于口内局部用药,通过短时间的药物接触后能持续抑制变形链球菌生长,从而达到抑龋目的。根据以上实验结果,可初步得出蜂房提取物能抑制口腔致龋菌的生长,其最小抑菌浓度在4mg/ml左右。并且通过观察其对变形链球菌生长曲线的影响进一步探讨了其抑菌的机制。通过对蜂房提取物成分的分析,首次发现其中含有α-谷甾醇和α-胡萝卜甙,并且这2种成分