超螺旋质粒dna纯化工艺的研究

超螺旋质粒dna纯化工艺的研究

自20世纪90年代美国威斯康兴大学的wolff教授发现dna可直接诱导免疫反应，并提出以科学家为基础的新疫苗。核酸疫苗具有安全性高和操作简便等优点,因此逐渐成为预防、治疗和诊断癌症、艾滋病等疾病的重要手段之一。然而,获得大量高纯度的质粒DNA比较困难,且超螺旋质粒DNA纯度需达到90%以上。本研究采用Sepharose6FF去除RNA,避免了应用RNaseA所造成的动物源性酶类污染及需要去除等不便,再应用PlasmidSelectXtra去除线性质粒DNA,经SOURCE30Q精提,获得高纯度质粒DNA,为大规模制备基因治疗用质粒DNA奠定了基础。现将结果报道如下。1.材料和方法1.1-btbl-ox40l质粒pVAXI-MEG-p24-4-1BBL-OX40L由军事医学科学院军事兽医研究所病毒室构建并保存;大肠杆菌JM109由该所保存。1.2仪器和检测方法细菌内毒素检测试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司;BCA蛋白检测试剂盒购自海门碧云天生物技术研究所;AKTAExplorer100液相色谱仪及QuixStand中空纤维交叉流过滤系统、Sepharose6FF凝胶、PlasmidSelectXtra和SOURCE30Q均购自美国GE公司;核酸蛋白检测仪购自美国Pharmacia公司;酶标仪购自美国Awareness公司;PCR扩增仪(GeneAmpPCRSystem9600)为PERKIN-ELMER公司产品。1.3s1293—细菌发酵无菌条件下,将质粒pVAXI-MEG-p24-4-1BBL-OX40L转化感受态大肠杆菌JM109。挑取单个菌落,接种至4mlLB培养液(含50μg/ml卡那霉素)中,37℃,250r/min振摇培养至A≈0.6,再接种至1LLB培养液(含50μg/ml卡那霉素)中,37℃,250r/min揺床培养16h作为发酵菌种,以同样的方法培养5份菌体备用。1.4过滤层浓缩条件采用QuixStand中空纤维交叉流过滤系统搜集菌体,纤维柱型号为CFP-2-E-4X2MA(孔径0.2μm,纤维管内径1mm,滤膜面积0.085m2,滤柱流道长度60cm),浓缩条件为TMP:1psi,flux:60LMH。将5L菌体浓度为2%的菌液浓缩至170ml(菌体浓度约60%),用时1h。1.5洗涤液的配置采用溶液Ⅰ(25mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,50mmol/LGlucose,pH8.0)作为洗涤液,并逐渐替换培养液。用碱裂解法裂解菌体,将回收换液后的菌液加入340ml溶液Ⅱ[200mmol/LNaOH,1%(w/v)SDS]中,混匀后冰浴5min,立即加入255ml溶液Ⅲ(3mol/LKOAc,5mol/LCH3COOH),充分振荡,冰浴30min,用200目滤网过滤,去除杂质,保留滤液。1.6纤维管/滤膜浓缩采用型号为UFP-300-E-4X2MA的中空纤维柱(孔径300000NMWC,纤维管内径1mm,滤膜面积0.085m2,滤柱流道长度60cm)浓缩,浓缩条件为TMP:17psi,flux:25LMH。将765ml裂解液浓缩至150ml(约5倍浓缩),用时1h。1.7压力装柱法结果按照GE公司说明书方法装柱,利用AKTA色谱系统恒流速压力装柱法完成,最终各柱的柱床体积分别为:凝胶层析柱392ml,柱高20cm;亲和层析柱20ml,柱高10cm;离子交换层析柱20ml,柱高10cm。1.8优质粒dna的纯度1.8.1平衡柱床流采用Sepharose6FF去除RNA,用5×CV溶液A[2.1mol/L(NH4)2SO4,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5]平衡柱床(流速10ml/min)。将浓缩的裂解液按10ml/min的流速上样,以10ml/min的流速用溶液B[2.0mol/L(NH4)2SO4,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5]洗脱。1.8.2nacl-pcr法纯化质粒dna1.6cm×10cm层析柱内装填体积压积(CV)为20ml的PlasmidSelectXtra,用5×CV溶液C[0.3mol/LNaCl,1.7mol/L(NH4)2SO4,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5]平衡柱床(流速4ml/min)。将第一步收集的纯化质粒DNA按流速4ml/min上样后,以4ml/min的流速用溶液B洗脱,将线性质粒DNA洗脱除去。以3.5ml/min的流速用溶液C洗脱,收集超螺旋质粒DNA。1.8.3纯化样品的制备1.6cm×10cm层析柱内装填CV为20ml的SOURCE30Q,用5×CV溶液D(0.4mol/LNaCl,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5)平衡柱床(流速4ml/min)。确定上一步收集的纯化样品体积,以2倍体积的H2O稀释,将稀释的样品按4ml/min的流速上样,并确保样品的电导率高于溶液D。继续以4ml/min的流速用溶液D洗脱,将杂质除去。最后以4ml/min的流速用溶液E(1.0mol/LNaCl,10mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,pH7.5)洗脱,收集超螺旋质粒DNA。1.9对纯粒dna的检测1.9.1琼脂糖凝胶电泳分析用含0.5μg/ml溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶电泳分析洗脱样品成分,电泳结束后,置凝胶成像仪紫外灯下成像并拍照。1.9.2dna纯度检测根据洗脱样品电泳结果,将质粒DNA收集管样品混合,于核酸蛋白检测仪260nm波长处测定A值,以A260/280表示质粒DNA的纯度。1.9.4检测内毒素含量参照使用说明书,用终点显色法细菌内毒素检测试剂盒检测质粒DNA内毒素含量。1.9.5pcr检测试验按照文献方法,挑取单个大肠杆菌JM109菌落,接种于4mlLB培养液中,培养16h后,小量提取质粒,作为染色体DNAPCR阳性对照,取2μl待检样品用于检测。根据DNAsis软件分析大肠杆菌染色体序列,选取保守的RNaseR基因中的460bp作为扩增片段设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物为:5′-atggcttctgtcaacgctgtt-3′;下游引物为:5′-aaaactgcctggcacagcaatt-3′。PCR反应条件为:95℃5min;94℃30s,55℃40s,72℃90s,30个循环;72℃10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。2.结果2.1优质粒dna的纯度2.1.1收峰的测定用B液作为洗脱液,在层析图谱上可见2个吸收峰,见图1。电泳结果表明,RNA得到有效分离,并且通过Sepharose6FF可以去除部分线性质粒DNA,见图2。2.1.2超螺旋质粒dna峰用B液作为洗脱液,出现第1个吸收峰即线性质粒DNA峰,待吸收曲线趋于平稳后,用C液作为洗脱液,出现第2峰即超螺旋质粒DNA峰,见图3。电泳结果表明,PlasmidSelectXtra凝胶可有效除去样品中的松弛型及线性质粒DNA,见图4。2.1.3质粒dna用溶液D洗脱去除杂质,再以溶液E洗脱,收集超螺旋质粒DNA,见图5。电泳结果表明,所收集的超螺旋质粒较纯,经扫描分析,超螺旋结构质粒达到样品总质粒的91.2%,经ClaⅠ酶切鉴定结果正确,见图6。2.2对纯粒dna的检测2.2.1纯度2.2.2蛋白质残渣用BCA检测试剂盒几乎检测不到蛋白质残留(-2.62mg/ml),表明质粒DNA中的蛋白质杂质被有效去除。2.2.3内毒素含量2.2.4剩余的胎盘dna文件3.超滤系统与离子筛层析分离质粒sec近年来,防治各种疾病的核酸疫苗不断问世,需要摸索出一套成熟的适合大规模生产的质粒DNA纯化技术,以适应未来疫苗的发展。同时,国家食品药品监督管理局也颁布了《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》,提出产品质量标准如下:超螺旋质粒纯度大于90%;宿主蛋白残留量小于0.001μg/μg;残余宿主DNA含量不超过0.002μg/μg;琼脂糖凝胶电泳未见明显条带;内毒素含量小于10EU/μg;总纯度(A260/A280)大于1.75;鉴别试验经酶切电泳后符合酶切图谱。本实验采用中空纤维超滤系统回收菌体,该系统与其他形式的平面膜过滤系统相比较,具有超滤膜孔径小、液体流动的剪切力大、过滤时不易产生浓差极化等优点,提高了过滤效果,而且可以去除部分RNA。实验表明,使用中空纤维超滤系统可以完全替代离心机收菌,用离心机收菌生产设备成本高,生产周期长,而且生产过程易于污染。以往浓缩质粒主要靠透析来完成,这种方法主要的弊端是透析时间长,透析的量少,且操作繁琐易污染,透析时间不好掌握,质粒损失大,回收率低,不适合大规模生产。本实验采用中空纤维柱浓缩质粒,速度快,质粒损失少,适合用于大规模生产。本实验采用三步柱层析法进行质粒的纯化,即分子筛层析、亲和层析及离子交换层析。分子筛层析(SEC)是利用质粒DNA的大小和构象进行分离纯化,可单独使用,也可在离子交换等其他层析步骤之后应用。SEC可去除gDNA和RNA等杂质污染,也可降低内毒素含量。本实验采用Sepharose6FF作为分子筛填料进行分离纯化,结果去除了几乎全部RNA,给生产带来了极大的便利。传统的质粒DNA纯化工艺中,去除RNA的方法是加入牛RNase来降解RNA,既增加了成本,又有传播疯牛病的风险,另外还需在纯化工艺中增加去除RNase的纯化步骤,增加了纯化成本,不利于工业化生产。亲和层析是利用超螺旋构型的质粒的亲和力比对松弛异构体的亲和力高而进行分离纯化的,从电泳结果看,分离效果较理想,该柱也具有去除内毒素的作用。离子交换层析是根据混合物中不同分子所带电荷性质的差异进行分离纯化的一种层析技术,在纯化目的分子的同时,可去除内毒素和杂质[9~11]。从检测结果看,所有检测指标均符合并高于国家食品药品监督管理局颁布的《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》中规定的质量标准。综上所述,该套纯化工艺操作简易,柱再生能力强,质粒回收率高,适用于大规