菠菜内生拮抗细菌的分离、筛选与鉴定

菠菜内生拮抗细菌的分离、筛选与鉴定摘要：从菠菜叶片上和菜园土壤中分离细菌，筛选出对菠菜霜霉病菌或菠菜炭疽病菌拮抗作用强的菌株，并挑选出生活力强、适应性好、防病效果好的作为目标菌株，并其鉴定到种。技术路线：菠菜内生细菌的分离拮抗菌株的筛选目标菌株的鉴定拮抗菌株的生物学测定1实验材料1.1样品来源菠菜菜园内土壤和菠菜植株。1.2供试病原菌菠菜霜霉病菌(Peronosporaeffusa)和菠菜炭疽病菌(Colletotrichumspinaciae),由本实验室分离和鉴定。1.3培养基细菌的分离用NA、KB和TSA。细菌的培养用NA或LB。细菌的菌种保存用NA或YPA。真菌的培养与拮抗测定用PDA。细菌的生理生化测定用基础培养基。1.4标准菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)标准菌株。西瓜细菌性果斑病病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulliWillemsetal.1992)标准菌株Aac7500。1.5溶液与试剂草酸铵结品紫染剂，鲁戈尔碘液，番红复染剂，西萨一基尔染媒剂，苯酚品红染剂，7.6%孔雀绿水溶液，1%漠百里酚蓝水溶液，甲基红试剂，0.3%肌酸水溶液，格里斯试剂，吲哚试剂，10%(W/V)FeCl3溶液，1%二甲基对苯撑二胺水溶液，3%(v/v)过氧化氢。2实验方法2.1菠菜内生细菌的分离从菠菜的健叶和病叶上取样，各取1.0g，先用70%酒精浸泡5min，再用0.2%升汞表面消毒2-3min，无菌水冲洗3次。取0.5ml最后1次无菌水冲洗液涂布接种于各种培养基上。每个处理重复3次，培养48h，观察有无菌落产生。据此验证此消毒方法是否能全部杀死供试材料表面微生物。样品晾十后转入无菌研钵中研磨匀浆，加5ml无菌水碾碎，静止15min后，各取50l涂平板，每处理重复3次，30°C黑暗培养48-72h，计算菌落数。根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，按常规方法纯化后保存，供测试鉴定。2.2菠菜病原菌拮抗菌株的筛选采用对峙生长法，测定以上分离菌株对菠菜霜霉病菌或菠菜炭疽病菌的拮抗性。具体步骤：在直径为9cm的PDA平板中央接入直径为8mm的病原真菌菌块，同时在平板四个边缘距中央中心处接入一小环目标菌株菌落(37C，NA上培养24h)，28C下黑暗培养，设不接种的为对照。3d后观察各个菌株对病菌的拮抗效果。2.3拮抗菌株的鉴定2.3.1常规测定革兰氏染色将细菌接种在斜面上，25C培养24〜28h后，用结品紫草酸铵染色法进行染色，镜检。鞭毛染色将细菌在斜面上培养18〜24h后，用西萨一基尔染色法进行染色，镜检。芽孢染色将菌株培养48〜72h后，用孔雀绿藏红染色法染色，然后镜检。2.3.2生理生化测定葡萄糖氧化发酵实验培养基：蛋白胨2.0g，NaCl5.0g，K2HPO40.2g，葡萄糖10.0g，琼脂6.0g，漠百里酚蓝，1%水溶液3ml,蒸馏水1000.0ml，pH7.0-7.2，分装，灭菌。穿刺接种，每株4支，其中两支用灭菌的凡士林封盖，约0.5—1cm，以隔绝空气为闭管，另两支不封为开管，同时用不接种的闭管和开管作对照。适温培养1、2、3、7、14d观察结果。只有开管产酸变黄者为氧化型，开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。硝酸盐还原试验每支试管分装5mL含有硝酸盐的培养基(KNO31.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，琼脂3.0g，蒸馏水1000.0ml，pH7.0-7.2)，灭菌后每个菌株针刺接种4管，其中2支用3%琼脂封管，置25C培养2周，若在封管的琼脂下有气泡产生，表示有脱氮的作用，未封管的试管在培养3、5、7d后用Griess-Liosvary试剂(试剂A：对氨基苯磺酸8.0g，5N醋酸1000.0ml；试剂B：二甲-a-奈胺6.0ml，5N醋酸1000.0ml)测定，每管加试剂A和B各1ml，如呈红色，表示有亚硝酸根。明胶液化每支试管分装5ml含明胶的培养基(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，明胶120.0g，蒸馏水1000.0mL)，灭菌后穿刺接种细菌，置25C下培养，定期观察明胶是否液化。淀粉水解细菌接种在淀粉培养基平板上(牛肉膏2.0g，蛋白胨17.5g，淀粉1.5g，琼脂17.0g,蒸馏水1000.0mL，pH7.0)，置25°C下培养4小时，然后往平板上加碘液，此时培养基是否呈深蓝色，若菌落周围为无色透明圈者为阳性。苯丙氨酸脱氨酶将细菌在斜面(培养基：酵母膏3g，NaCl5g，Na2HPO41g，琼脂12g，L一苯丙氨酸1g，蒸馏水1000mL)上37C培养4h或8〜24h测定，将试剂10%(W/V)的FeCl3溶液滴到斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明已形成了苯丙氨酸，不变则为阴性。吲哚的产生把细菌接种于1%胰胨水溶液中适温培养1、2、4、7d后，沿管壁缓慢加入3〜5mm高的试剂于培养液表面，在液层面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加4〜5滴乙醚全培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮全液面后再加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。V-P测定将目标菌株在NA斜面上培养24〜48h，加入3〜5ml的蒸馏水，配成菌悬液，每管加入5ul的菌悬液标记分别培养2、4、6d，测试时将培养液体加入40%NaOH等量相混，加少许肌酸，过10min或更长观察结果，如果出现红色为阳性反应，否则为阴性。糖、醇类的利用芽孢杆菌培养基((NH4)2HPO41.0g，KCl0.2g，MgSO40.2g，酵母膏0.2g，琼脂5.0-6.0g，糖类或醇类(D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、乳糖或D-甘露醇)10.0g蒸馏水1000ml漠百里酚蓝0.04%)PH7.0-7.2分装试管112oC灭菌30min。穿刺接种25C培养1、3、5d后观察，如果变黄色说明阳性不变或变蓝说明阴性。接触酶测定将24h培养的目标菌株，以铂丝接种环抹一小环于滴有3%的过氧化氢玻片上，如果有气泡产生则为阳性，如果无气泡为阴性。(10)柠檬酸盐的利用将目标菌株在NA斜面上培养24h〜48h，加入3〜5ml的蒸馏水配成菌悬液，每管加入50ul的菌悬液混合，过1、3、7d后观察，如果由绿色变成蓝色并有明显气泡产生则为阳性反应，无明显变兰色则为阴性反应。2.4拮抗菌株的生物学功能测定2.4.1拮抗性测定采用夹层法测定拮抗菌株对菠菜霜霉病菌菌丝或菠菜炭疽病菌菌丝的抑制率。具体步骤:在100mL熔解后冷却至45C左右的PDA培养基中加入1mL拮抗菌株菌液(含菌量3x108CFU/mL)，混匀后制成含菌平板(约15mL培养基)，然后平板中央接入直径为8mm的病原真菌菌块。28C下黑暗培养，设不接种的为对照。5和7d分别测量抑菌圈直径(mm)和真菌菌落直径(mm)。抑制率的计算公式：抑制率(%)=(对照真菌菌落直径一受抑制真菌菌落直径)/对照真菌菌落直径x100。采用载玻片悬滴法测定拮抗菌株对菠菜霜霉病菌孢子囊萌发或菠菜炭疽病菌分生孢子萌发的抑制作用。具体的做法是用直径为5mm的打孔器在上述抑菌圈边缘切取菌块，用定量无菌水制成孢子囊或分生孢子的悬浮液，血球计数板计算每菌块中的孢子囊数或分生孢子数，以正常培养的病菌菌丝块为对照，计算孢子囊形成或分生孢子形成的抑制率（％）。分别用目标菌株培养液（28°C、180rpm、培养48h）和清水配制病原菌孢子囊或分生孢子悬浮液，用载玻片悬滴法室温培养，观察孢子囊或分生孢子的萌发率（%）。2.4.2内生性测定用逐步筛选法，筛选抗利福平的突变菌株，即将供试菌株转入含50^g/mlRif.的NA平板培养基中培养，挑取生长的突变体菌株，再接入同一Rif.浓度的NA培养基，继代一次后转入下一个含有2倍Rif浓度的培养基中，直至筛选出抗300rg/mlRif.的并能在NA培养基平板上定生长且菌落形态保持不变的抗利福平突变体菌株。把抗Rif突变菌株在含300rg/mlRif.的NB培养基中振荡培养（37C，180r/min）24h，然后用培养液（含菌量约为5X106cfu/ml）喷雾接种菠菜幼苗，接种量为5mL/株。常规条件下进行肥水和栽培管理，以不接菌为空白对照。3、7、10、14、21和30d分别取样，每次收集菠菜2g。样品经70%酒精和0.1%升汞表面消毒后，无菌水冲洗3次，加定量无菌水研磨匀浆，静止15min后，吸取适量液体涂于含300rg/mLRif.的NA平板，每处理重复3次，37C黑暗培养48h，计算菌落数。分离时各处理组织在表面消毒清洗后，于分离平板上进行表面印迹培养，48h长菌的相应分离处理为无效试验。观察分离菌株在NA平板上的生长菌落。2.4.3防病测定拮抗菌株的接种采用喷雾法；菠菜病原菌的接种采用灌根法或针刺法，测定拮抗菌株对茶轮斑病的防病效果。接种时拮抗菌株稀释成3x108CFU/mL的菌悬液，茶轮斑病菌配成104孢子/mL的孢子悬浮液。设同时接种拮抗菌株和菠菜病菌、先接种目标菌株24h后接种菠菜病菌和先接种菠菜病菌24后接种拮抗菌株等3个处理，每处理重复3次，以只接种菠菜病菌、只接种清水和只接种培养基的处理为对照。26C下保湿培养48h后按正常管理，待发病后，每天记录发病情况，将病斑分为五级，计算各处理的病情指数。目标菌株防病效果的计算公式为：防病效果（％）=（病菌对照的病情指数一处理的病情指数）/病菌对照的病情指数x100。附录I培养基配方1营养琼脂培养基（NA）主要用于细菌的分离和培养，也可用于细菌的纯化和保存。不加琼脂粉，即配成营养肉汤（NB）培养液。培养基成分如下：蛋白胨5.0g牛肉浸膏3.0g葡萄糖2.5g酵母粉1.0g琼脂粉16.0〜18.0g蒸馏水1000mlpH7.0〜7.2配制方法：将称好的琼脂，加热熔化；另称取蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖和酵母粉，溶于少量热水后加入混匀；用5mol/LNaOH调节pH；然后加水定容至1000ml。分装试管或三角瓶后，121°C灭菌20min。2Luria-Bertani培养基（LB）本培养基营养比较充分，主要用于细菌的液体培养。加入16.0〜18.0g的琼脂粉，配成固体培养基。培养基成分：酵母粉5.0g胰蛋白胨10.0gNaCl10.0g蒸馏水1000mlpH7.2〜7.4配制方法：称取酵母粉、胰蛋白胨和NaCl，溶于适量蒸馏水；用5mol/LNaOH调节pH；然后加水定容至1000ml。分装试管或三角瓶后，121C灭菌20min。3金氏B培养基（KB）本培养基主要用于细菌（荧光假单胞杆菌）的分离。培养基成分：蛋白胨20.0gMgSO4・7H2O1.5gk2hpo4・h2o1.8g纯甘油10.0ml琼脂粉16.0〜18.0g蒸馏水1000mlpH7.2〜7.4配制方法：将称好的琼脂，加热熔化；另称量蛋白胨、MgSO4・7H2O、K2HPO4•H2O和纯甘油，溶于少量热水后加入混匀；用5mol/LNaOH调节pH；然后加水定容

至1000ml。分装三角瓶后，112°C灭菌30mino4胰蛋白胨大豆胨琼脂培养基（TSA）胰蛋白腺大豆腺NaCl琼脂蒸馏水胰蛋白腺大豆腺NaCl琼脂蒸馏水pH15.0g5.0g5.0g16.0〜18.0g1000ml7.2〜7.4配制方法：将称好的琼脂，加热熔化；另称取胰蛋白腺、大豆月东和NaCl,溶于少量热水后加入混匀；用5mol/LNaOH调节pH；然后加水定容至1000ml。分装三角瓶后，121C灭菌20min。5酵母粉琼脂培养基（YPA）本培养基营养较少，主要用于细菌的长期保存。培养基成分：TOC\o"1-5"\h\z酵母粉 3.0gNH4Cl 0.5gKCl 0.2gMgSO47H2O 0.2gK2HPO4 1.0g琼脂粉 5.0g蒸馏水 1000mlpH 7.0〜7.2配制方法：将称好的琼脂，加热熔化；另称量酵母粉、NH4Cl、KCl、MgSO4・7H2O和K2HPO4，溶于少量热水后加入混匀；用5mol/LNaOH调节pH；然后加水定容至1000ml。分装三角瓶后，112C灭菌30min。6基础培养基（CM）主要用于细菌糖或醇的利用和分解试验。加入3.0〜5.0g的琼脂粉，可以配成半固体培养基。培养基成分：TOC\o"1-5"\h\zNH4NO3 1.0gMgSO4.7H2O 0.5g（NH4）2SO4 0.5gKH2PO4 0.5gK2HPO4 1.5gNaCl 0.5g蒸馏水 1000mlpH 7.0〜7.2配制方法：先称取所有药品，溶于少量热水，调节pH后加入3ml1%漠百里酚蓝水溶液，待呈绿色，再加入糖、醇至终浓度为0.1〜0.2%，使之溶解，然后加水定容至1000ml。分装试管后，121°C灭菌20mino7蛋白胨水培养基主要用于细菌的糖或醇的发酵试验，也可用于细菌的硝酸盐还原试验。培养基成分：蛋白腺 10.0gNaCl 5.0g蒸馏水 1000mlpH 7.2〜7.4配制方法：先称取蛋白腺和NaCl，溶于少量热水，调节pH后加入溴甲酚紫（1.6%水溶液），待呈紫色，再加入糖、醇或KNO3至终浓度为0.1〜0.2%，使之溶解，然后加水定容至1000ml。分装试管后，最后将杜氏小管倒置放入试管中（观察试验中是否有产气）。121C灭菌20min。8马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）主要用于真菌的分离、培养和保存，以及细菌对真菌的拮抗测定。也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA。不加琼脂粉，即配成PDA培养液。培养基成分：马铃薯 200g葡萄糖（或蔗糖） 20.0g琼脂 16.0〜18.0g蒸馏水 1000mlpH 自然配制方法：将马铃薯洗净去皮，称量，切成小块，放入锅中，加蒸馏水1000ml，煮沸30min；稍冷后，用四层纱布滤去马铃薯残渣；将滤液放回锅中，加入称好的琼脂，加热熔化；然后加入葡萄糖或蔗糖，充分溶解后，补加蒸馏水，定容至1000ml。分装试管或三角瓶后，121C灭菌20min。1常用缓冲液（1）0.2mol/L磷酸盐缓冲液pH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/mlpH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/ml5.88.092.07.061.039.05.910.090.07.167.033.06.012.387.77.272.028.06.115.085.07.377.023.06.218.581.57.481.019.06.322.577.57.584.016.06.426.573.57.687.013.06.531.568.57.789.510.56.637.562.57.891.58.56.743.556.57.993.07.06.849.551.08.094.75.36.955.045.0注：NaHPO•2HO分子量=178.05,0.2mol/L溶液含35.61g/L；NaHPO•12HO分子量=2 4 2 2 4 2358.22,0.2mol/L溶液含71.64g/L；NaH2PO4•H2O分子量=138.01,0.2mol/L溶液含27.6g/L；NaH2PO4•2H2O分子量=156.03,0.2mol/L溶液含31.21g/L。(2)0.1mol/LTris-HCl缓冲液pHX/mlpHX/ml7.145.78.126.27.244.78.222.97.343.48.319.97.442.08.417.27.540.38.514.77.638.58.612.47.736.68.710.37.834.58.88.57.932.08.97.08.029.2注：三羟甲基氨基甲烷（Tris）分子量=121.14,0.1mol/L溶液为12.114g/L。50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tis）溶液于Xml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。Tris溶液可以从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。(3)0.2mol/L硼酸-硼砂缓冲液pH0.05mol/L硼砂/ml0.2mol/L硼酸/mlpH0.05mol/L硼砂/ml0.2mol/L硼酸/ml7.41.09.08.23.56.57.61.58.58.44.55.57.82.08.08.76.04.08.03.07.09.08.02.0注：硼砂Na2B4O7•10H2O分子量=381.43,0.05mol/L(=0.2mol/L硼酸根)溶液为19.07g/L；硼酸H3BO3分子量=61.84,0.2mol/L溶液为12.37g/L。硼砂易失去结晶水，必须在带塞的瓶中保存。(4)0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH0.1mol/L柠檬酸/ml0.1mol/L柠檬酸钠/mlpH0.1mol/L柠檬酸/ml0.1mol/L柠檬酸钠/ml3.018.61.45.08.211.83.217.22.85.27.312.73.416.04.05.46.413.63.614.95.15.65.514.53.814.06.05.84.715.34.013.16.96.03.816.24.212.37.76.22.817.24.411.48.66.42.018.04.610.39.76.610418.64.89.210.8注：柠檬酸C6H8O7・H2O分子量=210.14,0.1mol/L溶液含21.01g/L；柠檬酸钠Na3C6H5O7-2H2O分子量=294.12,0.1mol/L溶液含29.41g/L。(5)0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液pH0.2mol/LNaAc/ml0.2mol/LHAC/mlpH0.2mol/LNaAc/ml0.2mol/LHAC/ml3.60.759.254.85.904.103.81.208.805.07.003.004.01.808.205.27.902.104.22.657.355.48.601.404.43.706.305.69.100.904.64.905.105.89.400.60注：NaAc分子量=136.09,0.2mol/L溶液为27.22g/L。2细菌染色