代谢组学研究的现状与展望

代谢组学研究的现状与展望

1现有技术平台的发展状况和发展趋势代谢组是对生物系统进行激活或中断后（例如，在特定基因变异或环境变化后），代谢产物的变化或随着时间的推移而变化。生物系统代谢路径的研究是基因群学、蛋白质群学和可再生生物群学之后的一个新兴的“亚群学”，是系统生物学研究的重要组成部分。与其他组学相比,代谢组学有其显著优势:1)基因和蛋白表达的有效的微小变化会在代谢物上得到放大,更容易被检测;2)代谢组学的研究不需建立全基因组测序及大量表达序列标签(EST)的数据库;3)代谢物的数目远小于基因和蛋白质;4)组织中代谢物相差不大,研究中采用的技术更通用。代谢组学以生物体液为研究对象,包括尿液、胆汁、血浆、组织提取液、脑脊液、精液、唾液、膀胱液等,力求分析生物体系中的所有代谢产物,整个分析过程应能尽可能地保留和反映总体代谢产物的信息。完整的代谢组学分析的流程包括样品的采集和预处理、数据的采集和数据的分析及解释。完成对样品的预处理后,样品中的所有代谢产物需要通过合适的方法进行测定。目前,蛋白质组学、基因组学和转录组学等传统组学技术已经比较成熟,而代谢组学借助先进的分析化学仪器也逐步完善其技术平台,但新兴的代谢组学所分析的对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很大,要对它们进行无歧视的全面分析,现阶段还没有一种单一技术能够独立完成,这给传统分析化学技术带来了巨大的挑战。真正意义上的代谢组学研究是对所有的代谢产物进行定性定量分析,而目前人们进行的代谢组学研究一般是定量代谢轮廓分析和无歧视代谢指纹图谱分析,两者并不是真正意义上的代谢组学研究。在现有技术平台无法直接完成真正意义上的代谢组学研究的情况下,采用这两种代谢组学研究策略,从不同的生化途径分析代谢物,组成代谢物循环网络,从而达到研究大量代谢物的目的,不失为是当前代谢组学研究的一种有效途径。目前代谢组学技术平台主要是核磁共振技术(NMR)和质谱(MS)及其联用技术,其中NMR用于代谢组学的研究已比较成熟。NMR快速、选择性好,其样品处理简单且不造成破坏,只要含氢的代谢物都可以被检测,即可以对所有的分析对象达到无歧视分析。NMR可以提供全面完整的代谢物图谱而无需事先对样品进行选择性的衍生化和提前设定复杂的仪器测量参数,质谱中一些随参数设定变化的因素如样品雾化、离子化的问题等在NMR分析中可以很好的避免。在新发展的魔角旋转-核磁共振技术(MAS-NMR)中,仪器分辨率得到很大提高,可应用于生物样品的直接分析,应用日益广泛。然而,由于体液中所含组分众多,得到的NMR图谱较复杂,一种谱图很难对混和物进行快速确证;同时由于NMR的灵敏度较差,如要对所有代谢产物进行无歧视分析,生物样品中的痕量成分可能会因为被覆盖而检测不到。MS具有高选择性、检测限低等优点,同时与气相(GC)、液相(LC)等色谱分离技术有良好的兼容性,是代谢组学研究的理想工具,具有广阔的发展前景。代谢组学要求分析生物体系中所有的代谢产物,单一的分析技术难以满足这一要求,故联用技术越来越受到科学家们的重视。气质联用技术(GC-MS)具有高灵敏度、高重复性、可检库鉴定已知物等特点,其局限性是样品必须气化,且不能分析大分子、难挥发性物质和热不稳定性物质;核磁共振(NMR)对样品无损伤且重复性好,广泛应用于药物工业和病人的尿、血样分析,但其灵敏度不高,不能鉴定混合物;而液质联用技术(LC-MS)是具有高效、快速分离效能的LC与灵敏、准确的MS或MSn的结合,被广泛应用于难挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物(包括蛋白质、多肽、多糖、多聚物等)的分析,既可定性,也可定量,是最具前途的代谢组学的研究技术之一。随着液质联用技术领域中各种新型分离技术和检测技术的涌现,应用于代谢组学研究的技术平台一方面向高通量、高灵敏度和高分辨率的方向发展;另一方面向多维联用技术的角度发展。因此,综合利用各种技术的优势,力求全面表达生物体系的代谢信息,可大大推进代谢组学研究的进步。本文从适应当前代谢组学研究需要的平台技术的角度,系统研究了近年来各种液质联用新技术、新方法的进展,并对其在代谢组学领域中的应用研究进行了综述,以期为代谢组学研究提供新思路。2适应代谢组学的需要，开展液体质量联合技术的开发2.1反相柱色谱分离液相色谱被用来对进入质谱的样品进行分离,实现液质联用。液相色谱能减少离子抑制效应,根据同分异构体物理化学性质选择合适的色谱分离条件可以使其得到很好的分离,合适的液相色谱分离方法可以获得更好的检测限,并可以降低背景噪音获得更高质量的质谱数据。C-18反相柱,3-5μm直径填料的反相柱液相色谱系统被广泛地应用于代谢组学研究,且具有更高分离效果的毛细管柱液相色谱的应用将会增加。常规RP-HPLC在分离复杂生物样品时有明显不足之处,如分离度较低,对极性化合物的保留能力差。目前有两种解决方式:一是通过使用更小的色谱柱填料来增加峰容量和分离度,一是增加柱压。为此,具有更高分离能力和更高峰容量的UPLC系统的应用越来越广泛。反相柱色谱是分离非极性化合物和中等极性化合物的常用手段,但强极性代谢物在反相柱上不被保留,无法进行分析。因而能够分析极性化合物的HILIC系统在分析强极性化合物时越来越受到重视。Tolstikov等用HILIC分析了植物提取化合物中的强极性成分。Naidong对HILIC应用于LC-MS/MS系统分析生物样品进行了综述。2.2电喷雾质谱分析代谢组学研究要求对复杂生物体系中尽可能多的代谢产物进行分析,因此需要质谱对许多不同种类和结构的化合物进行同时电离分析,这给质谱离子化技术提出了很大的挑战。电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离技术(APCI)是近年来质谱离子化技术的主流手段,得到了很大的发展。ESI可分析的化合物种类十分庞大,包括有机合成化合物、药物及其代谢产物、天然产物、违禁药物、蛋白质、糖类、核苷及DNA、类脂、聚合物、无机物及金属有机化合物、富勒烯、表面活性剂、以及自组装膜和胶束等。ESI/MS兼容多种样品引入方式,如液相色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱、超临界色谱、凝胶色谱及更多的其他的进样方式。电喷雾包括纳升电喷雾,微升电喷雾,皮升电喷雾。ESI/MS在代谢组学研究中得到广泛的应用。VladimirV.Tolstikov等用HILIC-ESI-Q-trap/MS分离分析强极性化合物,并将PolyhydroxyethylA柱和TSKGelAmide80与常规硅胶柱对比,发现TSKGelAmide80柱分离效果好;ESI有正离子和负离子两种模式,与Q-TRAP/MS联用实现持续极性转换分析,充分获得被分析化合物离子信息。通过强度最高的离子峰逐级碎裂得到碎片离子,与质谱数据库相比较鉴定未知化合物。此方法被用来检测葫芦叶韧皮部分泌物中的低聚糖、氨基糖、氨基酸、糖苷等强极性化合物。外标法定量,柱检测达到0.5ng。HILIC-ESI-Q-TRAP/MS是代谢组学研究中分析低聚糖和糖苷等极性物质的有力工具,可以设想,在样品进入ESI/MS前,作为分离系统的HILIC与RP-HPLC联用将为在一个色谱系统中同时分析憎水性物质和亲水性物质提供一种有效途径。JeWonPark等用LC-ESI-MS/MS方法定量分析了放射菌类微生物中有机酸辅酶A酯类物质(shortorganicacid-CoAesters)。大气压化学电离技术(APCI)与ESI联系非常密切,APCI常用来分析小分子或非极性和弱极性化合物,较ESI更适合于正相液相色谱系统。2.3离子栈质谱质谱仪质谱仪的分类通常是按照其质量分析器的不同划分的,具体分为四级杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱以及复合式串联质谱,如串联四级杆-飞行时间质谱(Q-TOF)等。以下分别对这些质谱质量分析器技术作一简述。四级杆质谱四级杆质谱的主要优势是性能稳定可靠,且成本较低,可同时提供优质的定性和定量结果,其不足之处是只能得到低分辨质谱数据。四级杆质谱可以做准确的质量测定,但要求样品有相对较高的纯度,并且杂质的化学背景不能存在无法辨别的干扰。单四级杆质谱依靠选择离子检测(SIM)方式完成定量分析,SIM的检测限取决于目标化合物与样品中其他组分(包括背景离子)差异的程度。三级四级杆质谱(TQ-MS)可以实现MS/MS功能。TQ-MS质谱系统非常适合ESI-MS/MS定量分析,具有完备的分析功能,可以实现所有MS/MS扫描方式,包括子离子扫描,母离子扫描及中性丢失扫描。同时,三级四级杆采集到的MS/MS质谱图信息量大,较少发生重排反应和产生人为产物,因而四级杆的质谱数据质量要高于离子阱串联质谱数据。特殊用途的研究级四级杆质谱仪器已经解决了四级杆质谱常见的缺陷。离子阱质谱离子阱质谱仪是一种低-中分辨的质谱仪,研究级离子阱可以得到超高分辨率的质谱图。阱内捕获离子产生的空间电荷效应以及其他电场效应会导致被测离子频率的偏移,所以离子阱很难完成准确质量测定。离子阱产生的子离子质谱图通常只有几个主要碎片,需要使用多级质谱才能获得完整的子离子质谱。由于离子捕获时间较长,所以重排反应和离子-分子反应的可能性加大,从而出现人为产物。在离子阱内,生物大分子(如非共价键的亚铁血红蛋白复合物)的多电荷离子可以保持相对较长时间的稳定,可研究离子-分子反应(如气相的H/D交换)和离子-离子反应。阴离子和阳离子可以同时被捕获在离子阱内。由于离子阱质量分析器的动态范围不高,故离子阱质谱不适合做定量分析。但是,由于离子阱质谱具有成本低,相对较高的灵敏度以及MSn能力,它依然比较适合用作目标化合物的筛选和定性分析,可以用于代谢组学研究中生物标记物的鉴定。飞行时间质谱新型的TOF系统具有快速、高灵敏度和高分辨率的特点。正交加速(OA)可以接受连续的离子流,离子源连续产生的离子被引入到脉冲的TOF质量分析器,可十分有效地处理不同位置和不同能量的离子。反射式TOF质量分析器可进一步提高分辨率。TOF质量分析器总是在最大分辨率的条件下工作,且不需要通过降低分辨率来提高灵敏度。TOF质谱具有准确质量测定功能,用一个锁定质量及简单的校正公式就可以纠正很长范围的质量漂移。TOF可以精确测定目标化合物的质量数,因而被广泛地应用于生物标记物的定性鉴定。TOF还具有扫描速率快,质谱数据信息大的优点,同时能提供高分辨和高质量精度的数据,非常适合代谢组学分析。复合式串联质谱复合式质谱仪把把不同的质量分析器结合起来,如离子阱/飞行时间复合以及四级杆/飞行时间复合。复合式质谱仪可以充分发挥各质量分析器的优势,实现优势互补,可以预见,还有更多的质量分析器和碰撞活化方法能产生许多种新的组合方式,而这些复合式质谱仪的发展必将促使代谢组学的研究达到一个新的高度。Q-TOF具有高灵敏度的MS/MS功能,能对母离子和碎片离子作准确质量确定。R.E.Williamsa采用HPLC-Q-TOF/MS方法对D-丝氨酸诱导的肾损伤尿液中代谢物紊乱进行了代谢组学研究,分别在正、负离子模式下检测AlderelyPark老鼠尿液代谢物的变化。负离子模式下,丝氨酸、D-丝氨酸、甘油酸酯、色氨酸、苯基丙氨酸、乳酸盐含量有所增加,甲基琥珀酸和癸二酸含量有所减少。正离子模式下,黄尿酸含量减少。基于此,作者提出了D-丝氨酸诱导的肾损伤的作用机理。HPLC-IT-TOF/MS具有更高的灵敏度,能提供化合物离子的精确分子量,同时提供母离子和碎片离子信息,非常适合用于定量分析,是鉴定天然有机化合物并阐明其裂解机理的有力手段。HPLC-IT-TOF/MS在植物代谢组学研究中将会得到广泛的应用。3液体和质量联合技术在代谢研究中的应用3.1尿样代谢特征液质联用技术现在进行的工作主要集中在目标代谢物的分析上,常规HPLC-MS技术以其强大的分离能力和鉴定能力使人们认识到它可以被用于生物样品代谢指纹谱分析,但常规高效液相色谱质谱联用系统仍然有许多技术问题需要解决。主要有:1)系统稳定性和轮廓谱重现性差;2)分析时间长,超高效液相色谱对此有很大改善;3)进行单一分析时得到的分析物有限;4)样品预处理复杂,且基质干扰较大。其中最突出的两大色谱技术问题是:如何完成大量色谱峰的识别以及如何保证方法的重现性。Hai等经过优化分离参数、严格控制分离条件,获得了尿液和细胞样品的稳定的代谢轮廓和指纹图谱。Pham-Tuan等人全面考察了HPLC用于生物样品高通量的代谢物组学研究,提出一种利用短整体柱配以大流速、快梯度洗脱的分析方法,该方法能快速分析体液样品得到多信息代谢指纹图谱,并且容易质谱与联用。王玲等采用HPLC-ESI/MS对人口服毛果芸香碱后的尿样的代谢产物进行了研究,实验中并未在志愿者尿液中发现毛果芸香碱的葡萄糖醛酸结合物,但大鼠灌胃给药后的尿样中检测到了毛果芸香碱的葡萄糖醛酸结合物,表明药物在体内的代谢过程可能与种属有关,这将有助于人们认识新药研发过程中临床试验的重要性。Plumb等应用LC/MS完成了制药研究中对鼠尿中代谢产物的筛选。RobertS.Plumb等利用HPLC-MS对比分析大鼠给药后和对照组尿液代谢物指纹谱,利用PCA法成功实现给药组和对照组的分离,研究表明在代谢组学应用于药物开发中,HPLC-MS是NMR的行之有效的补充。LC-MS也是生物样品靶标分析的常规手段,液相色谱可以和各种质谱技术相结合,根据所要分析的对象选择不同的质谱类型,充分发挥各质谱仪器的优势,同时液相色谱本身也在向高通量,高分辨发展。HPLC-MSn能给出化合物丰富的碎片结构信息,为化合物的鉴定提供一条有效途径。沈朋等先从尿样HPLC分析数据中寻找出能反应乳腺癌代谢特征的一组代谢物,再用HPLC-MS/MS联用技术鉴定其结构,找到四种生物标记物,并将其作为诊断模式特征变量,诊断率达到90%以上。Beaudry等应用HPLC-MS/MS对鼠中普萘洛尔(propranolol)进行了代谢轮廓分析,并阐述了其降解的生化途径。JunYang等采用LC-MS/MS方法对正常人和肝病患者尿液进行代谢组学分析,获得七个标记物,用PCA法处理数据,进行分类研究,其假阳性率低于7.40%。3.2毛细管柱色谱常规液相色谱质谱联用系统可以被用于代谢组学分析,使用梯度洗脱可以使样品得到较好分离,但分析时间较长,且容易造成基线不稳定。进行代谢组学研究通常要求在尽量短的时间分析大量生物样品,这与常规液相色谱分析时间较长相矛盾,需要寻求具有更好分离能力的系统,毛细管柱色谱系统是一种可选择的技术,同时它能够减少离子源的离子抑制效应。J.Granger等应用毛细管柱HPLC(oa)-TOF/MS对雌性和雄性Zucker大鼠尿液进行代谢轮廓分析,并将毛细管柱HPLC与常规柱HPLC相比较,表明毛细管柱HPLC较常规柱HPLC有更高的灵敏度,获得更大峰容量。毛细管柱HPLC进样量更少,可以使进入离子源的溶剂离子减少,故可以得到质量更好的质谱图,且实验结果表明在进样量更少的情况下毛细管柱HPLC仍然较常规柱液相色谱具有更好的灵敏度。Tolstikov等应用C18毛细管硅胶整体柱HPLC-Trap/MS对拟南芥进行代谢组学分析,结果表明使用长毛细管对减弱离子抑制效应、增加分辨率和降低噪音是个行之有效的方法。3.3uplc-tof/ms的应用超高效液相色谱(UPLC)是waters公司最新推出的一种新型液相色谱技术,具有快速、高灵敏度、高通量的特点,具有最佳质谱入口,与质谱联用时不需要进行分流。分析时间的急剧缩短使代谢组学的相对高通量筛选成为可能。Eric等利用UPLC-TOF/MS比较生晒参和白参的图谱,从图谱我们可以很容易区别生晒参和白参。UPLC-TOF/MS在植物种属区别研究上有独特的优势。E.M.Lenz等采用UPLC-MS和1H-NMR分别独立地研究了普伐他汀对雌性大鼠尿液代谢物的影响,通过从大量动物实验研究中所获得的数据,借助统计分析,发现了三种毒性标志物,并得到临床证明。小柱径色谱柱可以减少进样量,并能在不影响分离效果的情况下获得更高的信噪比。FameiLi等利用UPLC-MS对淫羊藿治疗氢化可的松造成肾功能衰竭的大鼠尿液和血液进行代谢组学分析,在大鼠血液中发现四个淫羊藿活性组分,并在尿中检测出他们的两个代谢物。XinjieZhao等基于UPLC-TOF/MS对尿中核苷和含有顺二醇结构的代谢产物进行分析,并以此区分正常人和癌症患者,为癌症诊断提供临床依据。UPLC较HPLC能获得更多代谢物的信息,具有更高的分辨率和灵敏度,且实现快速分离,更好的重现性。PeiyuanYin等采用UPLC/Q-TOFMS对一系列肠瘘病人进行代谢组学研究并找到潜在生物标记物,而这些生物标记物有望阐明肠瘘病人的生物学特征。3.4ce-tof/ms检测CE-MS是分析离子型化合物的有力工具,其主要优点是具有非常高的分辨率,并能提供良好的质谱接口。TomoyoshiSoga等采用CE-MS进行微生物代谢物分析,从已知的代谢途径中成功地鉴定了352种标准化合物,并用CE-MS很容易地分析了枯草芽孢杆菌提取物中的1692种代谢物,鉴定其中150种,这个结果提供的信息有助于理解孢子的形成过程中代谢物的变化过程。为了实现高通量及定量分析1000余种代谢物,代谢物用CE分离,MS检测;同分异构体必须用CE分离达到能被MS检测区别的分离程度;为了使所有的代谢物离子都能得到鉴定,m/z范围定为70-1027;对阳离子代谢物,阴离子代谢物,核苷和乙酰辅酶A分别采用不同的CE-MS系统平行进行分析。CE-TOF/MS可以获得未知化合物的精确分子量,可用于对化合物进行鉴定,获得未知化合物经验分子式;CE-MS/MS可以获得化合物的碎片信息,从而对未知化合物进行结构鉴定。CE-MS可以分析所有的离子型代谢物,因而被广泛地应用于药物代谢、药物动力学等研究。代谢组学研究中,其中一个挑战是对生物样品中未知的痕量成分进行描述,RichardLee等等综合运用CE-ESI-IT/MS和计算机模拟的方法研究了大肠杆菌从肉汤培养基中选择吸取养分的过程。通过计算机模拟能够深刻理解代谢物电迁移动力学,并且实现毛细管内样品富集、脱盐及分离过程。CE-ESI-ITMS可以对样品进行在线预浓缩,较离线样品浓缩方法灵敏度提高了50倍,大肠杆菌阳离子代谢物的检测限达到纳摩尔级。基于CE-MS的代谢组学研究可以在缺少标准品的情况下描述未知代谢物,相信CE-MS在系统研究微生物细胞内和细胞外代谢物的改变方面将会更加广泛。3.5芯片灌注质谱LC-MS是代谢组学研究中对生物样品进行代谢轮廓分析的常用方法,但是LC-MS分析得到的代谢组学研究数据通常都伴有噪音高,信噪比低,保留时间不稳定,信号强度易变等缺点。对复杂生物样品(如血浆)来说,用快速色谱技术分析得到的结果重现性不好。自动纳升喷雾灌注系统用一个全新的芯片纳升电喷雾系统已经成功地应用于很多领域[50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60]。血浆经液液萃取后再经芯片灌注MS/MS分析,并与常规LC-MS/MS系统进行比较,结果表明前者的灵敏度是后者的80倍。Scholz等指出灌注质谱可以进行植物提取物的代谢组学研究,Dethy等同时认为芯片灌注质谱系统可以用于血浆中的生物药物分析。芯片灌注质谱具有使用方便,灵敏度高和重现性好等优点,高分辨的质谱和芯片灌注系统相结合将非常有利于代谢组学的研究。较长的数据获取时间,高灵敏度和动态范围的增加使得同时分析数百个化合物变为可能。同时,高度稀释的进样条件能够很好地改善离子抑制效应,并增加了分析结果的重现性。当前,液相色谱和chip/MS的联用技术应用还非常少,但液相色谱和chip/MS联用技术的强大功能必将对为代谢组学研究提供非常有力的技术平台,并促使代谢组学的发展。当前代谢组学研究的技术平台遇到的瓶颈问题是如何同时提高分析仪器的灵敏度和分辨率并在保证灵敏度的条件下对所有的生物样品进行分析,实现真正意义上的代谢组学研究。芯片灌注质谱系统无需对生物样品进行前处理,具有高通量、灵敏度高等特点,但和具有高通量并能对样品进行无歧视分析的NMR一样,芯片灌注质谱系统除了具有高分辨的优点外的同时也具有它本身的缺点。因为样品未经过色谱分离,所以芯片纳升电喷雾灌注质谱不能对具有相同精确分子量的同分异构体进行区别。可以预见,芯片纳升电喷雾灌注质谱与液相色谱联用将克服这一缺点,并将在代谢组学研究中发挥重大作用。3.6多维液相色谱分离多维色谱技术是采用多种色谱分离模式,分离复杂样品的有效办法。可采用柱切换技术实现在线分离,也可以用离线方法实现多维色谱分离,不同的分离模式需要不同的色谱柱。代谢组学研究中的生物样品,因为其含大量的极性、中等极性及非极性化合物,常用的反相柱对这些物理化学性质相差较大的化合物的保留能力和洗脱剂对这些化