马尾松和拟盘多毛孢的鉴定及其系统发育分析

马尾松和拟盘多毛孢的鉴定及其系统发育分析

在调查的200多种植物中，许多属于或种与记录的植物原生植物相同，但关于内部生殖丝和致病性的相互关系的研究很少。拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)的大多数种类,一个多世纪一直当作植物病原真菌来研究,直到20世纪90年代,才开始有内生拟盘多毛孢的报道。内生拟盘多毛孢与病原拟盘多毛孢之间的关系,至今未见有关报道。本研究在对内生拟盘多毛孢开展调查的同时,也从寄主植物病斑分离病原拟盘多毛孢,对内生拟盘多毛孢和病原拟盘多毛孢的rDNAITS区段和5.8S基因进行序列分析,从DNA分子的角度结合形态特征探讨内生拟盘多毛孢与病原拟盘多毛孢之间的关系。1材料和方法1.1拟盘多毛孢病原菌筛选开展罗汉松科(Podocarpaceae)、山茶科(Theaceae)和松科(Pinaceae)植物内生拟盘多毛孢调查,先后收集了3科植物内生拟盘多毛孢862个菌株,并采集马尾松(Pinusmassoniana)、罗汉松(Podocarpusmacrophyllus)、竹柏(Podocarpusnagi)、山茶(Camelliajaponica)、茶梅(C.sasanqua)和茶(C.sinensis)的病害标本,通过镜检并分离了病原拟盘多毛孢菌株86个(已完成离体接种试验),选择代表性菌株进行比较研究。1.2培养条件:pda+康乃非情况对水湿性的生长选代表性菌株36个,每个菌株经过单孢纯化,并统一以“PDA+康乃馨叶组织”作为培养基培养,根据GubaEF、SteyaertRL及NagRajTR1.3dna测序及序列分析将单孢纯化好的菌种移植于PAD平板培养基上,置黑暗条件25℃培养5～7d,待菌落长大到直径为5～6cm时,停止培养。DNA提取方法参照文献,采用引物ITS5和ITS4对rDNA的2个内转录间区和5.8S区约600个碱基对进行扩增,PCR产物测序由上海申能博彩公司用Go3SPCR产物纯化盒(Go3SPCRproductpurificationkitV3.0)纯化,在ABI377自动测序仪上直接测序。测序引物为ITS5和ITS4,测序后经拼接得到约600个碱基的序列片段(包含一段18S基因的尾部和一段28S基因的头端)。DNA序列数据分析:使用ClustalX软件对自测序列及从GenBank下载的相关序列共计44个进行序列比对(alignment),比对后的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列为545个碱基(含缺失位点),其中有114个简约性信息位点。以Amphisphaeriasp、Truncatellaangustata(7)和T.angustata(5)等3个序列作外群,用PAUP*4.0b10软件,用1000次重复的启发式搜索(heuristicsearch),所有的性状都是无序的,并给以相同的权重(转换和颠换的比率为1∶1),空隙当作碱基缺失,树分支的支持率通过自举法产生,得到1809棵简约树,进一步生成一棵多数一致树(majorityruletree)(图1)。用treeview32软件识别系统树。2结果与分析2.1不同植物种松叶斑的分离和鉴定先后从杭州、南宁和昆明等3个地方的不同植物叶斑标本上分离到病原拟盘多毛孢,根据形态鉴定了11种,其中从罗汉松叶斑标本上分离到7种,竹柏4种,山茶4种,茶2种,茶梅0种,云南红豆杉1种,南方红豆杉0种。从不同植物的健康组织分离鉴定出的内生拟盘多毛孢23种,其中从罗汉松上鉴定出16种,竹柏5种,山茶5种,茶5种,茶梅8种,云南红豆杉3种,南方红豆杉3种。通过对比发现,内生拟盘多毛孢在植物上的种类比病原拟盘多毛孢种类丰富(表1)。2.2内源性和外生物素的分子系统学关系2.2.1内生李氏拟盘多毛孢在系统树上,第9位是来自广西南宁马尾松上的病原罗氏拟盘多毛孢(P.lawsoniae)(菌株057),第10位是来自广东韶关马尾松上的内生罗氏拟盘多毛孢(菌株1018),它们在同一个分支上,其形态相同,DNA的ITS序列完全相同(表1,图1)。2.2.2tenii模型从表1和图1可知,系统树上17～18号小分支,都是卡斯特尼拟盘多毛孢(P.karstenii)。其中菌株201来自浙江杭州,从山茶的叶片病斑上分离到的病原拟盘多毛孢,菌株307来自广西南宁,从山茶枝条分离到的内生拟盘多毛孢,这2个菌株分生孢子形态和rDNA分子的ITS区段完全相同(2个菌株之间rDNA的ITS区段同源性为100%)。2.2.3dna的同源分析在系统树上,第27位是来自浙江山茶叶斑上的病原石楠拟盘多毛孢(P.photiniae)(菌株204),第35位是来自广西马尾松松针上的病原石楠拟盘多毛孢(菌株286),第25位是来自广西山茶枝上的内生石楠拟盘多毛孢(菌株302),第31位是来自云南茶梅枝上的内生石楠拟盘多毛孢(菌株697),它们在同一个分支上,其形态相同,DNA的ITS序列同源率为99%(表1,图1)。2.2.4内生茶属可混收菌株茶拟盘多毛孢(P.theae)的6个菌株在系统树上独立形成一个亚分支(36～41号小分支),其中099、205和083这3个菌株是病原茶拟盘多毛孢,而310、312和318这3个菌株是内生茶拟盘多毛孢,它们来自不同的寄主植物,083、099和205这3个菌株来自茶,310和312这2个菌株来自金花茶,318菌株来自罗汉松;099菌株来自云南西双版纳,083和205菌株来自浙江杭州,310、312和318菌株来自广西南宁,但这6个菌株形态相同,rDNA的ITS区段基本相同(099、310、205和312这4个菌株之间的同源性为100%,这4个菌株与318、083等2个菌株之间rDNA的ITS区段同源性为99%,仅相差1个碱基)(表1,图1)。可见,来自不同植物种类、不同地方、不同部位的内生和病原的茶拟盘多毛孢相同。2.3拟盘多毛孢种的筛选来自不同科植物的拟盘多毛孢种,形态一致,分子序列也相同。从分子系统树可以看出,山茶科上的石楠拟盘多毛孢(菌株204、697和302)和松科(马尾松)的石楠拟盘多毛孢(菌株286)在同一分支上;山茶科上的茶拟盘多毛孢(菌株099、310、205、312和083)和罗汉松科的茶拟盘多毛孢(菌株318)在同一分支上(表1,图1)。这表明,拟盘多毛孢种类的定殖与植物种类没有特异关系。可见,拟盘多毛孢无论是内生的还是病原的,对植物专化性不明显,从裸子植物到被子植物都可成为定殖的寄主植物。2.4汉松果皮和茶树枝条的分离和鉴定同种拟盘多毛孢可以定殖在植物的不同器官。系统树上第2、4和5号位置都是异角状拟盘多毛孢(P.heterocornis),包含3个菌株,都来自罗汉松,其中菌株358分离自罗汉松枝条,菌株391分离自罗汉松果皮,菌株380分离自罗汉松树皮。系统树上第9和10号位置都是罗氏拟盘多毛孢,包含2个菌株,都来自马尾松,其中菌株057分离自马尾松针叶,菌株1018分离自马尾松枝条。系统树上第17和18号位置都是卡斯特尼拟盘多毛孢,包含2个菌株,都来自山茶,其中201号菌株来自山茶叶片,307号菌株来自山茶枝条;系统树上第36至41号位置都是茶拟盘多毛孢,其中菌株083、099、205、310来自山茶科植物的叶片,312号菌株来自山茶科植物的枝条,菌株318来自罗汉松的枝条(表1,图1)。拟盘多毛孢在植物叶片和枝条都可以定殖,在枝条上主要以内生的形式定殖,而在叶片上部分种类可引起病斑,部分种类内生。3讨论3.1植物内生真菌从前人调查过的植物内生真菌中,部分种类与植物病原真菌为相同物种,如Phyllostictasp.、Glomerellacingulata(Colltotrichumgloeosporioides)、Fusariumminiliforme、Alternariatenuissima等一直是重要的植物病原真菌,在内生真菌的名单中仍以这些属为常见和优势类群。Sieber等报道红赤杨(Alnusrubra)叶片内生真菌大部分是曾记载的植物病原真菌;Sieber等从形态、培养性状和生化特性3个方面对英国、瑞士和加拿大的桦木科赤杨属植物上的黑盘孢属(Melanconium)真菌进行研究,发现M.apiocarpum既可以表现无症状(内生),也可以表现出症状(病原);Sieber等在英国调查槭树(Acermacrophyllum)的内生真菌发现,其中2种内生真菌(Diplodinaacerina和Glomerellacingulata)广泛存在于木本植物中,对植物具有一定的毒性,已经作为除草剂开发使用。拟盘多毛孢属的情况也是如此,已被确定种名的内生拟盘多毛孢种类中,除P.jesteri、P.kunmingensis、P.hainanensis等3个种纯内生外,其他种类(如P.funerea、P.palmarum、P.microspora、P.theae和P.karstenii)都曾报道为重要的植物病原真菌。枯斑拟盘多毛孢(P.funerea)是松树的病原菌,又是红杉树的内生真菌;Lee等调查佛罗里达粗榧(TorreyataxifoliaArn.)(美国濒危树种)的内生真菌发现,内生小孢拟盘多毛孢(P.microspora)是优势的内生真菌,经在温室进行接种试验,可以产生与野外病原小孢拟盘多毛孢引起的粗榧病害症状相同;Worapong等报道从大叶桂分离到内生茶拟盘多毛孢(P.theae),因此认为该菌既可以表现为内生方式也可以表现为病原方式。本研究对罗汉松科、山茶科和松科植物内生拟盘多毛孢与病原拟盘多毛孢的菌株从形态和rDNAITS区段的碱基序列进行比较,证实内生和病原拟盘多毛孢是同种拟盘多毛孢的2种状态,拟盘多毛孢在植物组织内普遍以内生状态存在,在一定条件下可以转变为病原拟盘多毛孢。经对竹柏叶片进行试验,在叶片组织内生的部分内生拟盘多毛孢在受伤、接近衰亡且湿度很高时可转变为病原拟盘多毛孢,导致出现叶斑病。至今,在内生真菌的研究报道中尚未界定内生真菌和潜伏侵染的病原真菌之间的界限。据多年对拟盘多毛孢的观察,在枝条上尚未找到由拟盘多毛孢引起的病斑,表明在枝条组织中的内生拟盘多毛孢无法转变成病原物。从大多数植物叶片内能分离到内生拟盘多毛孢,而只有少数植物的叶片会出现由拟盘多毛孢引起的叶斑病,在出现拟盘多毛孢叶斑病的植物种类中,部分的内生拟盘多毛孢条件性地转变为潜伏侵染的病原拟盘多毛孢。3.2内生真菌属tiopluspalmarumRamos-Mariano等报道了对巴西椰子树内生真菌的调查结果,掌状拟盘多毛孢(Pestalotiopsispalmarum)定殖率为32.9%,是椰子树定殖频率最高的内生真菌。作者对杭州、南宁和昆明的罗汉松科、山茶科和松科部分植物种类的内生拟盘多毛孢和病原拟盘多毛孢进行采样分离比较发现,内生拟盘多毛孢在所调查的几种木本植物组