高效液相色谱-荧光检测法测定烟用香精香料中的4种禁限用添加剂

高效液相色谱-荧光检测法测定烟用香精香料中的4种禁限用添加剂

香精华香料在香烟中的添加可以改善香烟的理化特性，润香，装饰香烟，改善吸味，确立产品风格。烟用香料是从带香物质中提取或以人工合成方法得到并且用于烟草中的致香物质的总称。通常情况下,烟用香精是由多种香料和适量溶剂及其他添加剂按照一定的比例和工艺调配而成。在添加剂中,由于芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素均有致癌作用,因此被禁止或限制使用。目前烟草行业分别颁布了β-萘酚、β-细辛醚的检测标准,均采用气相色谱-质谱联用(GC/MS)方法;李晶等利用超高效液相色谱-紫外检测(UPLC-UV)方法测定了香精香料中芝麻酚,而黄樟素的测定方法则主要采用GC/MS。GC/MS测定β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素所需时间较长,UPLC-UV方法专一性较差且易受基质干扰,而液相色谱-荧光检测(HPLC-FD)方法具有检测速度快、灵敏度高、选择性好等优点。由于芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素均具有较强的荧光响应,且采用HPLC-FD法检测烟用香精香料中上述4种禁限用物质的研究未见报道,因此,建立了同时测定上述4种物质的HPLC-FD方法,旨在为烟用香精香料的质量安全控制提供参考。1.1--细醚-超纯水仪仪19个烟用香精香料样品(2013年湖北省烟草产品质量监督检验站接受的委托检测样留样)。甲醇、乙醇、乙腈(色谱纯,德国CNW公司);芝麻酚(纯度≥98.0%,上海诗丹德生物技术有限公司);β-萘酚(纯度≥99.0%)、β-细辛醚(纯度≥71.0%;德国Dr.Ehrenstorfer公司;黄樟素(纯度99.4%,美国ChemService公司)。DionexP680高效液相色谱仪(配有RF2000荧光检测器,美国Dionex公司);AL204电子天平(感量:0.0001g,瑞士MettlerToledo公司);Milli-QAdvantageA10超纯水仪(美国Millipore公司);HY-5A回旋式振荡器(金坛市城东新瑞仪器厂);0.45μm有机相滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)。1.2产物的hplc-fd分析称取0.5g烟用香精香料样品于50mL锥形瓶中,准确加入10mL乙醇,在振荡器上以200r/min速率振荡20min,静置后过0.45μm有机相滤膜,进行HPLC-FD分析。分析条件为:色谱柱:PhenomenexLunaC18柱(150mm×4.6mmi.d.,5μm,100Å);柱温:30℃;流速:1mL/min;流动相:A:水,B:乙腈;洗脱梯度:0~5min,60%A线性降至5%A,并保持7min;12~14min,5%A线性升至60%A,并保持1min;进样量:20μL;总分析时间:15min;荧光检测条件如表1所示。2结果与讨论2.1萃取溶剂的选择为选择合适的萃取溶剂,通过在同一样品中加标的方法,选择甲醇、乙醇、乙腈为萃取溶剂进行实验,测定结果(表2)表明,甲醇、乙醇和乙腈的萃取效率相当,考虑到甲醇和乙腈的毒性较大,实验选择乙醇为萃取溶剂。2.1.2萃取剂体积的选择r.取同一种样品4份,分别加入5,10,15和20mL乙醇进行萃取,并进行HPLC-FD分析。结果发现,选择5mL乙醇时,萃取液必须离心,操作较繁琐,而萃取体积较大时,目标物的信号响应值较小。因此,兼顾样品萃取完全和检测准确度,实验选择萃取剂体积为10mL。香精香料中添加剂萃取方式较多,本实验中考察了超声和振荡两种方式的萃取效果。结果表明,在25℃下振荡和超声萃取效果相当,考虑到超声萃取的温度不易控制,因此选择振荡萃取的方式。2.1.4振荡时间对提取效率的影响在其他条件不变的情况下,考察了振荡时间分别为10,15,20,25和30min时的提取效率。结果(图1)显示,随着振荡时间的增加,被检出的添加剂的浓度逐渐增大,当振荡时间达到20min后,继续增加时间提取效率没有明显变化。因此选择振荡时间为20min。2.2剂量响应的测定由于芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素的最大激发波长相差较大,因此采用梯度方法改变最大激发波长和发射波长,如表1所示,在此条件下,标准样品中的4种添加剂响应值较高。实验还参考文献[17-18],考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-乙酸水溶液等不同体系及比例流动相下样品的分离情况,发现当流动相体系选择乙腈-水为体系梯度洗脱时,标准样品及实际样品中4种添加剂的分离效果最佳,标准溶液和典型样品的色谱图如图2所示,其中β-细辛醚由于异构体的存在,图形为双峰(图2a)。由图2可以看出,采用荧光检测方法的基质干扰小。2.3标准曲线与定量检出限以乙醇为溶剂,配制4种添加剂浓度分别为0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,5和10μg/mL的系列标准混合溶液,并分别对其进行HPLC-FD分析,采用外标法定量,以各目标物的峰面积(Y)对其相应浓度(X,μg/mL)进行回归分析,得到各目标物的回归方程及相关系数,如表3所示。由表3可知,4种添加剂测定标准曲线的线性关系良好,r=0.9996~0.9998。将最低浓度的标准溶液稀释并进行HPLC-FD分析,以3倍信噪比(S/N)和10S/N确定各目标物的定性检出限(LOD)和定量检出限(LOQ),则4种添加剂的LOD为0.01~0.09mg/kg,LOQ为0.04~0.29mg/kg(表3)。综上可知,在优化的实验条件下4种添加剂得到了良好的分离,方法的灵敏度较高,适合于定量分析。2.4加标回收率实验按照低、中、高3个含量水平(0.05,0.2和2μg/mL)分别在样品中加入4种添加剂标准溶液,每种添加浓度进行6次平行实验,根据分析结果计算方法的加标回收率及其相对标准偏差(RSD)。结果(表4)表明,本方法的回收率高、重复性好。2.5与gc/ms和hplc-uv方法比较烟用香精香料中芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素4种禁限用添加剂的检测方法大多是GC/MS法,与YC/T361—2010中β-细辛醚、YC/T376—2010中β-萘酚、文献中芝麻酚以及文献中黄樟素的GC/MS检测相比,本方法的检测时间更短、检出限更低,且前处理不需要除水,操作更为简单。与HPLC-UV法检测香精香料中芝麻酚、β-萘酚和黄樟素的文献及药品中β-细辛醚的HPLC-UV检测方法相比,本方法的检出限更低,检测时间更短,本方法与GC/MS和HPLC-UV方法的结果比较如表5所示。荧光检测法除灵敏度较高的优点外,选择性也较高,基质干扰较小,并且还实现了4种禁限用添加剂的同时检测。2.6禁限用添加剂检测采用本方法检测了2013年湖北省烟草产品质量监督检验站接受的委托检测样留样,19个烟用香精香料样品中均未检出芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素这4种添加剂,说明烟草行业对禁限用添加剂的控制非常严格,4种禁限用添加剂在烟草行业中的使用比较规范。3香精香料添加剂回收率建立了同时检测烟用香精香料中芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素的HPLC-FD方法。本方法简单快速、灵敏度高,回收率在86.4%~112.1