第二章 原核微生物

第二章微生物的纯培养和显微技术(原核微生物)

第一节微生物纯培养

本节提要：

微生物纯培养的接种方法

灭菌与无菌操作

微生物的保藏技术

纯培养（pureculture）：

单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。

对于微生物，由于其主要进行无性繁殖，故纯培养即为克隆。建立纯培养，证实其纯度无可置疑，并保持不受污染是微生物学家最重要的任务之一。（即控制无杂菌）

一、获得纯培养的方法：

平板分离法液体分离法单细胞挑取分离法选择性培养基分离法（一）.平板分离法：

1、划线分离法：快速、方便。

分段划线（适用于浓度较大的样品）

连续划线（适用于浓度较小的样品）

扇形划线

方格划线2、稀释倾注分离法：

可定性、定量。

方法：先取稀释液注入平皿，再注入45℃左右的培养基，将稀释液冲开培养基表面、中间均会出现菌落。

3、涂布平板法（培养基表面出现菌落）

简单易行，但易造成机械损伤。

（二）液体分离法

适用于细胞较大的微生物。用液体培养基对菌液做10倍系列稀释，使试管中只存在一个细胞，由此繁殖得到的后代必是纯培养。

（三）单细胞（单孢子）分离法

较大的微生物可用毛细管挑取单个个体；个体较小的微生物，需用显微操作仪，在显微镜下进行。

（四）.选择培养分离（通常做成固体的培养基）利用选择培养基进行直接分离。富集培养。即利用不同微生物间的生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使适应该条件的微生物旺盛生长，其数量大大增加，便于分离到特定的微生物

固体培养各种微生物形成的菌落特征

固体培养各种微生物形成的菌落特征

二、纯培养的接种方法

根据菌的生长速度的快慢来选择斜面接种、液体接种。

（一）斜面接种：

为保存菌种和获得大量菌种

（1）密涂布法(适用于各种M，可获得大量菌体）

（2）蛇形划线法(适用于易扩散的M）

（3）中央划线法（适用于生长快的M）

（4）点种法（适用于真菌短时间保存菌种）

（二）穿刺接种法：

用于接种试管深层琼脂培养基，以观察细菌运动及鉴定细菌用。

（三）液体接种法

用接种针在液面边缘-----产生混浊------搅匀、振荡

三、无菌技术无菌操作：防止微生物进入物体的技术。无菌：指没有活的微生物（包括芽孢）。死亡：指不可逆地丧失了生长繁殖的能力。除菌：应用机械的方法（过滤、离心分离、静电吸附）除去液体或气体中的微生物。灭菌操作：

杀灭所有微生物

常用

湿热灭菌：高压蒸汽灭菌

干热灭菌：空气加热灭菌

高温灼烧：用火直接接触烧灭

四、菌种保藏

传代培养保藏

冷冻保藏

干燥保藏第二节

显微镜和显微技术

一、显微镜的种类及原理（p21-25）种类

普通光学显微镜

暗视野显微镜

相差显微镜

荧光显微镜

透射电子显微镜(transmission

electronmicroscopeTEM)

扫描电子显微镜(SEM)

扫描隧道显微镜(STM）

原子力显微镜(AFM)

2.原理

显微镜的作用主要是放大作用。一般利用目镜和物镜两组透镜来放大成像，组成由机械装置和光学系统两大部分。

除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重要的因素，即分辨率和反差。

分辨率：指辨别两点之间最小距离的能力。即最小可分辨能力。

0.5λ

分辨率=-----------

nsinθ

显微镜的分辨率的比较图，书23页图2-10

反差：样品区别于背景的程度

与显微镜的自身特点有关；显微观察时对显微镜的正确使用；良好的标本制作和观察技术，

二、显微技术

1.良好标本的制备光学显微镜的制样活体观察

压滴法、悬滴法、菌丝埋片法

染色观察

活菌染色、

死菌染色

正染色和负染色

电子显微镜的制样透射电镜样品的制备

电子的穿透能力有限，需采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。

常用负染技术

投影技术

超薄切片技术

扫描电镜样品的制备主要要求干燥，并且表面能够导电，常用自然干燥、真空干燥、冷冻干燥等。

干燥、喷镀金属导电层后观察。2、分析技术对显微镜的正确使用

了解显微镜的构造和性能。观察技术不仅观察物体的形态、结构，可进行的摄影技术，而且与计算科学技术结合的图像分析、模拟仿真技术。对物体的组成成分定性和定量。

第二节原核微生物

1.原核微生物的特点

1）没有发育完全的核，DNA高度折叠为核区，拟核；

2）没有细胞器，细胞膜内陷形成不规则泡沫结构体系；

3）不进行有丝分裂。2.本章授课重点细菌、放线菌、蓝细菌第一节细菌（bacteria）一、细胞的形态构造及其功能（一）形态和染色球状杆状螺旋状基本形态一、细胞的形态和大小（一）细菌形态1、球状

细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。分有：单球菌、双球菌（肺炎球菌）、四联球菌、八叠球菌（甲烷球菌）、链球菌、葡萄球菌。一、细胞的形态构造及其功能（一）细菌的形态2、杆状

细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。分有：单杆菌、双杆菌和链杆菌。炭疽病的病原菌

-------炭疽杆菌一、细胞的形态和大小（一）细菌形态3、螺旋菌螺旋菌呈螺旋卷曲状，螺纹不满一圈的称为弧菌。一、细胞的形态构造及其功能（一）形态和染色3、螺旋状弧菌螺旋菌螺旋体菌弧菌：菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。蛭弧菌霍乱弧菌螺旋菌：菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异。鞭毛二端生细胞壁坚韧，菌体较硬。二、细菌的大小与重量细菌的大小测量单位是um大小的测量方法显微镜测微尺显微照相后根据放大倍数进行测算细菌的大小以微米（µm）计。

多数球菌的大小（直径）为0.5～2.0µm；杆菌（长×宽）为（1～5）×（0.5～1.0）µm；螺旋菌（宽度×弯曲长度）为（0.25～1.7）×（2～60）µm；另外，细菌的大小与个体的发育情况有关，刚分裂的新细菌小，随发育逐渐变大，老化后又变小。二、细胞的结构一般结构：细菌都有的构造特殊结构：部分细菌具有的或一般细菌在特殊环境下才有的1、细菌细胞的一般构造

细胞壁（cellwall）是位于细胞体表最外层，内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧且略具弹性的细胞结构。约占干重的10－25%。1）细胞壁（cell

wall)

不同细菌的细胞壁化学组成和结构不同，通过革兰氏染色法可将所有的细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）。

细菌是单细胞结构。(1)革兰氏阳性菌（G+)的细胞壁成分

G+菌细胞壁化学组成以肽聚糖(peptidoglycan)为主。这是原核微生物所特有的成份，占细胞壁物质总量的40～90%。另外还含有磷壁酸及少量的蛋白质和脂肪。

G+菌细胞壁较厚，约为20～80nm，结构简单。(2)革兰氏阴性菌（G—）的细胞壁成分主要成份为：脂多糖、磷脂、脂蛋白、肽聚糖，G－有肽聚糖，仅占细胞壁干重的5-10%。G—细胞壁很薄，厚度约为10nm，但它的组成和结构比G+更复杂。分为外壁和内壁。其中，外壁又可分为三层：最外层为脂多糖，中间层为磷脂层，内层为脂蛋白。肽聚糖：肽聚糖是由N—乙酰胞壁酸（NAM）和N—乙酰葡萄糖胺（NAG）双糖以及少数氨基酸短肽链组成的亚单位聚合而成的大分子复合体呈长链骨架状。肽聚糖单体p40

由NAG和NAM

双糖、四个氨基酸分子按L型与D型交替连接的肽尾或侧链、肽桥或肽间桥构成。

3）肽聚糖的特点:

1)为原核生物所特有(古细菌例外)；

2)D-Glu,D-Ala,M-DAP在自然界蛋白质中不存在（M-DAP是一种在原核微生物细胞壁上才有的内消旋二氨基庚二酸）；

3)个别菌中DAP可为Lys代替；

4)一般由五个氨基酸组成肽桥连接肽尾，个别菌中两肽尾可直接由肽键连接，肽聚糖的多样性就是变化在肽桥上。

革兰氏阴性菌

肽聚糖

肽聚糖网格状结构:

磷壁酸又名垣酸，是大多数G+菌所特有的成分，约占细胞壁成分的10%。

(3)G+细菌与G-细菌细胞壁的比较细菌壁厚nm肽聚糖％磷壁酸％脂多糖％蛋白质％脂肪％G+20～8040～90+-约201～4G-1010-+约6011～22总结：1.G+菌具有大量的肽聚糖，独含磷壁酸，不含脂多糖；2.G-菌含有少量的肽聚糖，独含脂多糖，蛋白质含量较多，不含磷壁酸。细胞壁的生理功能1.保护原生质体免受渗透压引起的破裂作用；2.维持细菌的形态。溶菌酶处理不同形态的菌体细胞壁后，菌体均呈球状。3.细胞壁为多孔结构的分子筛，可以阻挡某些分子的进入。4.细胞壁为鞭毛提供支点，使鞭毛运动。2）、细胞膜（1）细胞概念：

细胞质膜（cytoplasmicmembrane），又称质膜（plasmamembrane）、细胞膜（cellmembrane）或内膜（innermembrane），是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8nm。约占细菌体重的10％左右。（2）细胞膜的化学组成与结构模型：细胞膜的化学组成主要为蛋白质、脂类和多糖。蛋白质（占50%～70%）脂类为磷脂（占20%～30%）多糖约占2％。（2）细胞膜的化学组成与结构模型：亲水的极性端疏水的非极性端（3）细胞膜的生理功能：①是维持细胞内正常渗透压的屏障；选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送；②含有合成细胞壁和形成横膈膜组分的酶，合成细胞壁重要基地；③膜内陷形成中间体，含有叶绿素，参与光合作用。还有吗？（3）细胞膜的生理功能：④膜上含有氧化磷酸化、NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶等能量代谢的酶系，在细胞质膜上进行物质代谢和能量代谢，是细胞的产能场所；⑤细胞质膜上有鞭毛基粒，是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位；细胞质的主要成分为核糖体、内含颗粒、多种酶类和中间代谢物、质粒、各种营养物和大分子的单体等。3）细胞质和内含物（1）概念：细胞质（cytoplasm）是细胞质膜包围的除核区外的一切半透明、胶状、颗粒状物质的总称。含水量约80%。核糖体是细胞质中的一种核糖核蛋白的颗粒状物质，由核糖核酸RNA(60%)和蛋白质(40%)组成，常以游离状态或多聚核糖状态分布于细胞质中。它是蛋白质的合成场所。(2)核糖体(ribosome)（3）贮藏物(reservematerials)：即内含颗粒贮藏物是一类由不同化学成分累积而成的不溶性沉淀颗粒。当细菌生长到成熟阶段，因营养过剩而形成。主要功能是贮存营养物。①异染粒(metachromaticgranules)因其可用蓝色的染料（甲苯胺蓝或甲烯蓝）颗粒大小为0.5～1.0μm，是无机偏磷酸的聚合物，一般在含磷丰富的环境下形成。功能是贮藏磷元素和能量，当老龄细菌中，异染粒常被用作碳源和磷源。②聚-β-羟丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)为脂溶性物质，不溶于水。很容易被脂溶性染料苏丹黑着染，在光学显微镜下清晰可见。当缺乏营养时，被用作碳源和磷源。③硫粒一些硫化菌如：贝日阿托氏菌可以利用H2S作为能源，氧化为硫粒积累在菌体，当缺乏营养时，氧化体内硫粒为SO42-,从中获得能量。硫粒具有很好的折光性，在光学显微镜下可轻松看到。④肝糖和淀粉粒均可用碘染色，前者为红褐色，后者为蓝色，二者可作为碳源和能源。

细胞内含物(Madiganetal.,2000)A.细胞中的硫滴B.聚β—羟基丁酸颗粒

⑤气泡（gasvocuole）

许多光合营养型、无鞭毛运动的水生细菌中存在的充满气体的泡囊状内含物，大小为0.2～1.0μm×75nm，内由数排柱形小空泡组成，外有2nm厚的蛋白质膜包裹。功能：调节细胞比重以使细胞漂浮在最适水层中获取光能、O2和营养物质通常，一种菌含有一种或两种内含颗粒。4）核区（nuclearregionorarea）原核生物所特有的无核膜结构、无固定形态的原始细胞核。没有核膜和核仁。它由DNA高度折叠组成。例如：大肠杆菌体长为1～2微米，但其DNA长度为1100微米，等于菌体的1000倍，由于高度折叠而只占菌体的很小一部分。拟核携带着细菌的全部遗传信息，其功能就是：决定着细菌的遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。2、细菌细胞的特殊结构1）、荚膜荚膜是一部分细菌在细胞壁表面分泌的一种粘性物质，将细胞壁完全包围封在里边。荚膜将细菌与外界相对稳定的分开，二者有明显的分界边缘。当有足够的O2，C/N较高是，好氧菌易形成荚膜。荚膜一般很厚，但有的也很薄，当小于200微米时，称为微荚膜。2、细菌细胞的特殊结构1）、荚膜荚膜的化学组成：含水率在90～98％，其他有机组分为多糖或多肽。多数：水+多糖少数：水+多肽正是由于含水很多，荚膜很难在显微镜下被清晰观察到。但又很难被染料着色，为了观察清楚，人们想出了一个好办法。2、细菌细胞的特殊结构1）、荚膜负染色法又称衬托法1.先染菌体。2.再将背景染成黑色。在菌体及背景的衬托下，二者之间会出现透明区，就是荚膜，在显微镜下清晰可见。2、细菌细胞的特殊结构2、细菌细胞的特殊结构1）、荚膜荚膜的功能：1.具有荚膜的S-型肺炎链球菌毒力强，有助于侵入人体。2.具有保护功能。免受噬菌体的吞噬；免受干燥影响。3.当缺乏营养时，可作为碳源和能源，有的可作氮源。4.具有生物吸附作用。在污水生物处理中可将水中的有机物吸附到菌体上。2）粘液层有些细菌不产生荚膜，仍分泌粘液的多糖，其疏松的粘附在菌体细胞壁表面上，与外界没有明显的边缘。在污水处理中也有一定的生物吸附功能。3）菌胶团有些细菌由于遗传特性，细菌一定的方式互相粘结在一起，并被一个公共的荚膜包围形成一定形状的细菌集团，称作菌胶团。形状有：蘑菇形、分支状、球形等。见课本P30图1.2-6。在污水处理中也有一定的生物吸附功能。4）、

鞭毛(flagellum)（1）概念某些细菌细胞表面着生的一至数十条长丝状、螺旋形的附属物，这就是鞭毛。具有推动细菌运动功能，为细菌的“运动器官”。鞭毛的直径为0.001～0.02µm

，长短不一，在2～50µm之间。2）、

鞭毛(flagellum)

鞭毛的有无和着生方式单端鞭毛端生丛毛两端生鞭毛周生鞭毛5）、特殊的休眠构造——芽孢（1）概念某些细菌在其生长发育后期或遇到不良环境时，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢（spore，偶译“内生孢子”）。

所有的芽孢都可以抵挡外界不良环境。它是抵挡外界不良环境的休眠体。5）、特殊的休眠构造——芽孢（1）概念（2）细菌芽孢的特点整个生物界中抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞；产芽孢细菌的保藏多用其芽孢。产芽孢的细菌多为杆菌，也有一些球菌。芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。芽孢与营养细胞相比化学组成存在较大差异，容易在光学显微镜下观察。（相差显微镜直接观察；芽孢染色）（3）芽孢的抵抗机制芽孢与母细胞相比不论化学组成、细微结构、生理功能等方面都完全不同。1.含水率低，38～40％。（细菌平均含水率在70～90％。）2.芽孢壁厚而致密。分为三层，外层为蛋白质性质，中层为皮层，由肽聚糖构成。内层为孢子壁，肽聚糖构成。芽孢萌发时，孢子壁形成细胞壁。3.含有耐热性的2，6—吡啶二羧酸。芽孢变成细胞时，2，6—吡啶二羧酸消失。4.含有耐热性的酶。（3）芽孢的抵抗机制由于芽孢具有上述本领，可以对不良环境：高温、干燥、光线、化学药物有很强的抵抗力。例如：细菌的营养细胞在70～80℃时10min就会死亡，可芽孢在120～140℃时可生存几个小时。细菌主要是通过无性繁殖产生后代。其繁殖方式是二分裂，简称裂殖。细菌的繁殖过程分为三个连续步骤：①核的分裂和隔膜的形成；②横隔壁形成；③子细胞分裂。另外有的细菌还存在：三分裂和复分裂。三、细菌的分裂（三）细菌的繁殖1、裂殖（fission）1）、二分裂（binaryfission）四、细菌的群体形态（一）在固体培养基上（内）的培养特征固体培养基：含有1.5～2.0％琼脂细菌在固体培养基上的培养特征为菌落特征。菌落：将单个细胞接种到培养基上，给予一定的培养条件，细菌就会在固体培养基上迅速繁殖形成一个由无数细菌组成的群落。不同的菌落的特征有所不同。包括形态、大小、颜色、透明度等四、细菌的群体形态四、细菌的群体形态（一）、在固体培养基上（内）的培养特征菌落特征有三个方面：1.菌落表面特征光滑还是粗糙，干燥还是湿润。肺炎球菌，表面光滑，湿润。称为光滑型菌落。枯草芽孢杆菌，表面干燥、粗糙，称为粗糙型菌落。2.菌落的边缘特征圆形、锯齿状、边缘花瓣形等。3.纵剖面的特征平坦、扁平、隆起、草帽状等。固体培养各种微生物形成的菌落特征

四、细菌的群体形态（二）、在半固体培养基上（内）的培养特征半固体培养基：含有0.3～0.5％琼脂可以判断细菌的呼吸类型如果细菌在培养基中的表面及穿刺线上部生长，则为好氧菌。如果沿着穿刺线自上而下生长，则为兼性菌。若只在穿刺线下部生长，则为厌氧菌。可以判断细菌的运动能力如果细菌只沿着穿刺线生长，则为没有鞭毛的细菌，没有运动能力。若不但沿着穿刺线生长，且穿透培养基扩散生长，则为具有鞭毛的有运动能力的细菌。（三）、在液体培养基上（内）的群体形态（一）细菌的表面电荷和等电点细菌体50％为蛋白质，蛋白质由20种氨基酸按一定的排列顺序由肽键连接而成。氨基酸为两性物质。在碱性溶液中带有负电，在酸性溶液中带有正电荷。当溶液在一定的Ph值溶液中，氨基酸所带正电荷和负电荷相等时的Ph值，称为该氨基酸的等电点。五、细菌的物理化学性质（一）细菌的表面电荷和等电点由氨基酸组成的蛋白质也是两性物质，也有等电点。细菌细胞壁含有蛋白质，也就有等电点。已知细菌的等电点在Ph为2～5。革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。当细菌的培养液Ph值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷。五、细菌的物理化学性质（二）细菌的染色原理及方法1.染色原理细菌为无色透明，显微镜下不易观察，将菌体染成一定颜色，与背景加强反差。常用染料：碱性的结晶紫、碱性品红、甲基紫等。酸性的有酸性品红、刚果红等。一般用碱性染料。细菌与染料的亲和力与Ph有关。五、细菌的物理化学性质（二）细菌的染色原理及方法2.染色方法简单染色法和复合染色法。简单染色法：只用一种染料染菌体，只是为了增强菌体与背景的反差，便于观察。复合染色法：两种染料，以区别不同的细菌的染色反映；或将菌体和某个结构染成不同颜色，便于观察。五、细菌的物理化学性质细菌的鉴别染色法——革兰氏染色法（如图）

C.Gram

丹麦医生发明：

步骤：

涂片固定---结晶紫初染1min---碘液媒染1min---95%乙醇脱色0.5min

---番红复染1min。

结果:

阳性菌——紫色；

阴性菌——红色。

五、细菌的物理化学性质（二）细菌的染色原理及方法3.革兰氏染色法革兰氏:丹麦细菌家，由他研究的染色法。1）无菌条件下，将部分细菌置于载玻片上，涂匀；2）用草酸铵结晶紫染色1min，水洗去浮色；3）用碘－碘化钾溶液染1min，去掉多余溶液；4）用中性的脱色剂如乙醇脱色，革兰氏阳性菌不褪色呈紫色，革兰氏阴性菌褪色呈无色。5）用蕃红复染1min，阳性菌为紫色，阴性菌为红色。（二）细菌的染色原理及方法4.革兰氏染色法的机制1）革兰氏染色与等电点有关革兰氏阳性菌2～3，阴性菌4～5，在碱性染色剂中阳性菌带电荷多，与染料的结合力大。用碘－碘化钾媒染时，都降低了等电点，但阳性菌降的多，与染料的结合力更大（相对阴性菌）。当用乙醇脱色时，阴性菌被脱色，阳性菌不褪色。五、细菌的物理化学性质（二）细菌的染色原理及方法4.革兰氏染色法的机制2）革兰氏染色与细胞壁有关革兰氏阳性菌含有40～90的肽聚糖，很少的脂类1～4％。革兰氏阴性菌含有很多的脂类11～22，较少的肽聚糖10％。用乙醇脱色时，对于阴性菌，乙醇可以溶解脂类在细胞壁形成较大的孔径及通透性，乙醇可轻易进入阴性细菌降染料提取出来，使菌体呈无色。对于阳性菌，由于脂类少，但肽聚糖高，乙醇又是脱水剂，使肽聚糖脱水，导致细胞壁的孔径变小，通透性变差，阻止乙醇进入菌体内，阳性菌不褪色。五、细菌的物理化学性质（三）细菌悬液的稳定性五、细菌的物理化学性质细菌在液体培养基中有稳定和不稳定两种状态。稳定型的称为S型：即光滑型。整个菌体为亲水基，可均匀分布在培养基中，不发生凝聚。不稳定型称为R型，即粗糙型。在细菌悬液中不稳定容易絮凝而沉到瓶底。细菌悬的稳定和不稳定性在污水处理中的意义？（三）细菌悬液的稳定性五、细菌的物理化学性质细菌悬的稳定和不稳定性在污水处理中有着极为重要的意义！特别在污水处理中的二沉池，处理效果与细菌悬的稳定程度密切。不稳定有利于取得较好的沉淀效果。R型受欢迎！（四）比表面积五、细菌的物理化学性质细菌体积虽小，但具有巨大的比表面积。有利于营养物质，也有利于代谢产物的排泄。第二节放线菌（Actinomyces）放线菌因其在固体培养基上呈辐射状生长而得名。多数为腐生菌。绝大多数为革兰氏阳性菌。放线菌大量存在于土壤中，其数量及分别情况仅次于细菌。在自然界物质循环中作用显著；可以改良土壤；可以用于堆肥；可以用于污水生物处理，还可以生产各种抗生素（红霉素、土霉素、链霉素、庆大霉素等），全球已知的4000多种抗生素