基因工程课件：第三章 大肠杆菌基因工程

第三章大肠杆菌基因工程Escherichiacoli

（SEM，×14000）

四、工程菌分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略二、大肠杆菌表达系统高效表达原理一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例第三章大肠杆菌基因工程原核细胞与真核细胞的差别因为可爱而爱你——优点遗传背景清楚，便于基因操作表达水平高，遗传较稳定

优良的工业性能：繁殖迅速、培养简单、操作方便、被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统一、大肠杆菌表达系统的优缺点你有不足，但你仍是最爱——缺点胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等）细胞周质内含有种类繁多的内毒素一、大肠杆菌表达系统的优缺点二、大肠杆菌表达系统高效表达原理1、表达载体的基本元件2、启动子与外源基因表达3、其它元件与外源基因表达

1、表达载体的基本元件A、目的基因：编码外源蛋白的结构基因B、转录元件：启动子、终止子C、翻译元件：核糖体结合位点、翻译起始位点D、克隆元件：克隆位点、复制原点、标记基因E、翻译后元件（非必须）：信号肽、融合肽2、启动子与外源基因表达*启动子是最强的表达调控元件，启动子的强弱对表达水平有决定性影响。（mRNA生成速率）*-10区和-35区六聚体盒子及间隔长度*启动子与转录起始点距离

大肠杆菌一般是6-9个碱基启动子*据转录调控模式分

组成型和诱导型2类

*大肠杆菌天然启动子（表达载体应用）

Plac、Ptrp、PL、PrecA（乳糖操纵子、色氨酸操纵子、噬菌体左早期操纵子、RecA）双Plac=2.4Plac启动子保守序列-35区序列-10区序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac启动子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11PlacPtac=3Ptrp=11PlacPtrp的-35区与Plac的-10区组成型与诱导型启动子*无需诱导*整个生长过程一直不停地表达目的蛋白*一般采用基础代谢关键酶基因的启动子*不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白产物*表达量通常不高：过量或者有害表达影响细菌生长组成型表达系统组成型与诱导型启动子*只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物（防质粒丢失）*使生长相与表达相分开，避免表达与生长争营养和对菌体的毒害*可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解*特别适合解决有毒蛋白的表达*启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。诱导型表达系统P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高lacI负调控转录受CAP正调控和lacI负调控β半乳糖苷酶β半乳糖苷透过酶β半乳糖苷乙酰基转移酶P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高转录受CAP正调控和lacI负调控lacI负调控P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基高水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高转录受CAP正调控和lacI负调控lacI负调控P乳糖启动子PlacO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高转录受CAP正调控和lacI负调控lacI负调控PlacCAP正调控OPlacO高效转录葡萄糖代谢野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP基底水平转录结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP浓度降低PlacUV5O高效转录突变型乳糖启动子PlacUV5受lacI阻遏蛋白调控杂合型启动子PtacPtac

=

Ptrp

的-35区+

Plac的-10区Ptac

=

3

Ptrp

=

11

Plac（TTGACA）（TATAAT）*基于lacI调节模式的优点：可采用安慰诱导剂IPTG，不降解，稳定，最常用。*基于lacI调节模式的缺点：在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，无法应付多拷贝质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达。*改进措施：

A、采用能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq

突变菌株

B、在

载体上引入lacIq

基因基于lacI阻遏蛋白调控模式的改进l噬菌体启动子PL/

PR受CI阻遏蛋白阻遏常采用温度敏感型突变cI857cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达。PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表达色氨酸T7启动子——异源启动子T7启动子——最成功的启动子

*强大的T7启动子完全专一受控于T7RNA聚合酶，*T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶的快5倍*由于大肠杆菌本身不含T7RNA聚合酶，需要将外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌。*以Novagen公司的pET系统为杰出代表。T7启动子调控模式

IPTG诱导T7RNA聚合酶表达噬菌体DE3（lambda噬菌体的衍生株）含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。T7启动子调控模式

2.热诱导T7RNA聚合酶用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。T7启动子调控模式

3.溶氧诱导T7RNA聚合酶通过共转化质粒提供T7RNA聚合酶。用受溶氧浓度控制的启动子调控T7RNA聚合酶合成，以适合工业化发酵的条件控制。3.其它元件与外源基因表达

1）终止子2）核糖体结合位点3）质粒拷贝数（复制子）4）外源基因终止子外源基因本身的转录效率下降；干扰质粒的复制及抗性，导致重组质粒的不稳定性；产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。转录过头现象：

RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。核糖体结合位点核糖体结合位点（RBS）:

mRNA5‘端序列,包括SD、起始密码子、SD与起始密码子间的序列、起始密码子下游序列。

商品化大肠杆菌表达质粒均含有与启动子来源相同的RBS，序列和间隔是最佳的核糖体结合位点SD序列（Shine-Dalgarno）：

位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列（5’UAAGGAGG3’），它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。核糖体结合位点SD序列与起始密码子之间的距离的影响：

SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低核糖体结合位点SD序列与起始密码子之间的序列的影响：

SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍核糖体结合位点翻译起始密码子及其下游序列大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。起始效率差异：GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。lacI编码区GTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGA密码子宿主对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因满足宿主对密码子偏爱性偏爱性的策略密码子按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子。外源基因全合成（最常用）质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响（20000核糖体单位，600种mRNA1500分子）目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道质粒拷贝数质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子pCP3PLMCSoriApr在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60在42℃时，拷贝数迅速增至300-600在此温度下，受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达三、工程菌构建策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建包涵体型异源蛋白的表达包涵体（InclusionBodies）：

高效表达型工程菌大量合成异源蛋白质时所形成的水不溶性积聚物。性质：致密（密度大于细胞碎片和所有细胞器）、还含有宿主蛋白和少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。裸露或被膜包裹。

包涵体型异源蛋白的表达包涵体形成原因：

胞内新合成肽的折叠效率跟不上合成速度。表达产物结构形式：

部分属于折叠过程中的产物；部分为无序卷曲与聚集，分子内和分子间存在大量错配二硫键。包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点能简化外源基因表达产物的分离操作包涵体表达形式的优点：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能在一定程度上保持表达产物的结构稳定在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的操作如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体（如pET)。包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：表面活性剂SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化促溶剂盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应混合溶剂如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极端pH廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：通过次级键的形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：复性操作包涵体复性操作的方法包括：分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达分泌型异源蛋白的表达在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽(如ompE)序列的存在是蛋白质分泌的前提条件分泌型异源蛋白的表达蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感

以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳稳定性大约是在细胞质中的10倍目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质

N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠

杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍3、融合型异源蛋白的表达*将外源基因与标签（Tag)拼接在一起作为一个ORF进行表达*Tag可置于目的蛋白的N端或C端*通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白融合型异源蛋白的表达启动子Tag接头目的基因ATG/MetStopCNBr蛋白酶识别位点表达亲和层析酶解回收ORF以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高

受体菌自身蛋白目的蛋白易于分离

利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进目的蛋白表达率高

与受体蛋白共用一套完善的表达元件

胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段

行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白溶解性好

由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在缺点：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：Tag可满足亲和层析分离表达产物的需要两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架小分子肽与大分子Tag融合，反之则反用于融合蛋白构建的Tag谷胱甘肽转移酶（GST）维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（TrxA）维持良好空间构象pTrxFus麦芽糖结合蛋白（MBP）促进分泌外膜蛋白（OmpF）促进分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）维持良好空间构象His6易于亲和层析、不影响目的蛋白结构、无免疫原性Strep.Tag(8)-streptavidin高亲和力，温和洗脱，效果好目的蛋白的回收融合蛋白中Tag的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法酶促裂解法溴化氰（CNBr）：专一切除甲硫氨酸或其后多肽。优点：回收率高（可达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。缺点：如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法化学断裂法酶促裂解法单残基位点：蛋白内切酶切割位点梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假单孢菌蛋白酶Lys-C猪胰蛋白酶Arg-CLys-C几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的ArgCNNCTag目的蛋白酶促裂解法多残基位点(凝血因子Xa)加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物酶促裂解法：多残基位点PinpointXatac生物素结合肽编码序列Xa因子识别位点编码序列SP6T7AproriMCSATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArgGluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位点PreSicissionProteaseTag(5℃消化）*Intein:酵母来源的蛋白质剪接元件，类似于基因组中的内含子Intron在RNA的剪接中所起的重要作用，

intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，可以释放出与之相连的目的蛋白。*IMPACT：枯草杆菌的几丁质结合域（5KD，用于亲和纯化）和intein组成一个双效的fusiontag，再与克隆到多克隆位点的目的基因融合表达。*融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（4度）条件下用含DTT，或者巯基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脱，即可将目的蛋白洗脱基于蛋白质剪接元件Intein的IMPACT系统寡聚型异源蛋白的表达从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略寡聚型异源蛋白的表达以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白高效表达在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以稳定表达小分子短肽在一定程度上改善表达量目的产物回收困难短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性寡聚型异源蛋白的表达寡聚型目的蛋白表达系统的构建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本战略：寡聚型异源蛋白的表达寡聚型目的蛋白表达系统的构建构建举例：PSDT1T2EcoRIBamHIAATTCAGATCTGTCTAGAGCCTAGEcoRIBglIIBamHIEcoRIBamHIBglIIGATCTAGCCTAGEcoRIBamHIBglIIEcoRIBamHIBglIIEcoRI+BamHIBglII+BamHIBamHI整合型异源蛋白的表达防止丢失以整合形式表达目的蛋白的优缺点目的基因稳定表达整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续目的基因表达率低单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达元件而加以补偿培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程案例特别有意义整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生所谓的同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点同源序列依赖型的体内重组：基本形式整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：同源整合ori目的基因同源区域标记基因整合位点染色体DNA整合型异源蛋白的表达DNA体内重组的基本原理同源序列依赖型的体内重组：同源交换ori目的基因同源区域标记基因交换区域染色体DNAori标记基因+蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建大量的实验结果表明，在所有的极性氨基酸中，天门冬氨酸（Asp）的存在对提高蛋白质稳定性的效应最显著，而且Asp残基离C末端越近，蛋白质的稳定性就越大。更为重要的是，在多种结构和功能相互独立的蛋白质C末端引入Asp残基，都能显著地延长这些蛋白质的半衰期，因此具有普遍意义。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链C末端氨基酸序列对稳定性的影响：蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建大量的实验结果同时表明，如果多肽链的N末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，则蛋白质的稳定性显著改善。相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞内蛋白酶的超敏感区。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响：（蛋白酶缺陷受体菌）D基因工程菌的遗传不稳定性及其对策6大肠杆菌基因工程基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的表现形式

基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制重组质粒的逃逸率一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中称为重组质粒的宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有：高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）促使重组质粒渗漏（分泌至胞外）受体细胞中的核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧改善基因工程菌不稳定性的策略改进载体受体系统以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括：将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因改善基因工程菌不稳定性的策略施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营培养基复杂，成本较高养组份改善基因工程菌不稳定性的策略控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数优化基因工程菌的培养工艺培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定E利用重组大肠杆菌生产人胰岛素6大肠杆菌基因工程胰岛素的结构及其生物合成人胰岛素的生产方法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建胰岛素的结构及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高尔基体内的特异性肽酶NC信号肽B肽C肽A肽信号肽酶胰岛素原单链多肽活性胰岛素人胰岛素的生产方法直接提取法制人胰岛素迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。人胰岛素的生产方法化学合成法制人胰岛素根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。人胰岛素的生产方法基因工程法制人胰岛素1982年，美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链分