微生物的遗传和变异

微生物的遗传和变异本章要点：1.遗传变异的物质基础。2.基因突变的特点和机制。3.菌种如何选育及如何诱变育种?4.基因重组。5.基因工程的原理和操作环节。6.如何保藏菌种？5.1基因对遗传性状的控制5.1.1遗传和变异的物质基础DNA遗传变异的物质基础曾是生物学中激烈争论的重大问题。1944年Avery等人以微生物为研究对象进行的三个典型实验有力地证明了核酸是遗传物质，基因是其信息单位，染色体是其存在形式。一.证明核酸是遗传变异的物质基础的典型实验1.转化实验转化指A品系的生物吸取了来自B品系生物的遗传物质从而获得B品系的遗传性状的现象。转化现象是格里菲斯（Griffith）于1928年研究肺炎链球菌感染小白鼠的实验中发现，后经艾弗里（Avery）等于1944年证明的。2.噬菌体感染实验1952年，侯喜（A.D.Hershey）和蔡斯（M.Chase）为了证明噬菌体的遗传物质是DNA，用放射性同位素标记大肠杆菌T2噬菌体进行实验(图5-1)。 图5-1噬菌体感染实验3.植物病毒重建实验1956年Fraenkel-Conrat等用含RNA的烟草花叶病毒进行了病毒(TMV)重建实验(图5-2)，证明了RNA是遗传物质。图5-2TMV重建实验5.1.2DNA的构造与复制一.DNA的化学构成DNA是一种大分子化合物，由4种核苷酸构成。每一种核苷酸又由碱基、脱氧核糖和磷酸3部分构成。4种核苷酸的差别仅在于碱基不同。在DNA中，4种碱基是；腺嘌呤(adenine，A)、鸟嘌呤(guanine，G)、胞嘧啶(cytosine，C)和胸腺嘧啶(thymine，T)。脱氧核糖1位上的碳原子与嘌呤9位上的氮原子相连，5位上的碳原子与磷酸相连，就构成了4种不同的核苷酸。二.DNA的双螺旋构造模型1953年美国遗传学家沃森(JamesDewayWatson)和英国物理学家克里克(FrancisHarryComptonCrick)根据英国晶体衍射专家维尔金斯(MauriceHughFrederickWilkins)对脱氧核糖核酸的X射线衍射资料，以及碱基含量分析、键长键角资料、酸碱滴定数据等，提出了像麻花、油条同样扭在一起的DNA双螺旋构造模型（图5-3、5-4）。图5-3DNA的一级构造图5-4DNA分子双螺旋构造示意图三.DNA的复制通过实验证明，DNA的复制是以半保存复制(semiconservativereplication)形式进行的。其复制过程是这样的：首先碱基对间的氢键断裂，两条核苷酸链的螺旋松开，碱基显露出来，就像拉链同样拉开。然后以每条单链为模板，按照碱基对互补的规定，在DNA多聚酶的催化作用下，通过碱基配对，逐步合成一条新的核苷酸链，再和旧链形成新的双螺旋。5.2基因突变突变泛指细胞内(或病毒颗粒内)的遗传物质的分子构造或数量忽然发生的可遗传的变化。突变往往造成产生新的等位基因及新的体现型。狭义的突变专指基因突变，也称点突变，而广义的突变则涉及基因突变和染色体畸变。突变的概率普通很低，约为10-6×10-9。突变是工业微生物产生变种的本源，是育种的基础，但也是菌种发生退化的重要因素。5.2.1微生物突变体的重要类型基因突变的类型极为多样。人们可从不同的角度对基因突变进行分类，并给以不同的名称。根据突变体表型不同，可把突变分成下列几个类型：营养缺点型、抗性突变型、条件致死突变型、形态突变型、抗原突变型、其它突变型。5.2.2基因突变的分子基础一.碱基置换及其对遗传信息的影响碱基置换是指DNA中核苷酸的一种碱基被另一种碱基所取代。其中一种嘌呤被另一种嘧啶或是一种嘧啶被另一种嘌呤所取代（G→C或C→G），叫颠换(transversion)；如果一种嘌呤被另一种嘌呤或是一种嘧啶被另一种嘧啶所取代，称转换(transition)。根据它们对氨基酸序列的影响不同，可分为下列几个状况：1.同义突变：由于遗传密码含有简朴性，因此有些碱基替代并不造成氨基酸的变化。2.错义突变：指碱基替代后引发氨基酸序列的变化。有些错义突变严重影响到蛋白质的活性，甚至使活性完全丧失，从而影响了基因的表型。3.无义突变：编码区的单碱基突变造成终止密码子的形成，使mRNA的翻译提前终止，形成不完整的肽链，因而其产物普通是没有活性的。二.移码突变及其产生由于在DNA分子的编码区插入或缺失非3的整数倍个(1个、2个或4个)核苷酸而造成的阅读框架的位移。由于遗传信息是按3个碱基为一组依次排列而成的，蛋白质的翻译是从起始密码子开始，按密码子次序依次向下读码。当在起始密码子背面加入1个、2个或4个碱基后，则背面的全部密码子的阅读框都发生变化，成果翻译出来的蛋白质的氨基酸序列与野生型完全不同。固然，如果插入或缺失的碱基正好是3个或其整数倍，那么在翻译出的多肽上可能是多一种、几个或少一种、几个氨基酸，而不完全打乱整个氨基酸序列。三.缺失和重复大片段的缺失或重复(超出几个碱基对)是基因突变的重要因素之一。特别是在放线菌中的自发突变中，缺失或重复范畴从几个基因到几十个基因。5.2.3基因突变的特点一.不对应性：即突变的性状与引发突变的因素间无直接的对应关系。二.自发性：由于自然界环境因素的影响和微生物内在的生理生化特点，在没有人为诱发因素的状况下，多个遗传性状的变化能够自发地产生。三.稀有性：生物的基因自发突变是随时发生的，但发生的几率是很低的，即突变率很低，也很稳定，普通在10-6～10-9之间。这反映了物种和基因的相对稳定性。四.独立性：基因突变的发生普通是独立的，即在某一群体中既可能发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或其它某药品的突变型，并且还可发生不属抗药性的突变型。五.可诱变性：通过多个物理、化学诱变剂的作用，提高突变率，普通可提高10～105倍。六.可逆性：基因突变的过程是可逆的。普通存在于某种生物中的野生型基因A可突变为对应的基因a，这个过程称为正向突变；反之，由基因a也能够突变成野生型基因A，称为回复突变或回变。七.稳定性：突变的本源是遗传物质构造发生了稳定的变化，产生的变异性状是稳定的、可遗传的。5.2.4基因突变的机制突变是DNA分子构造或数目的变化。据引发变化的因素可分为自发突变和诱发突变；据DNA变化的程度可分为基因突变和染色体畸变。一.碱基置换A＝TT＝A颠换C＝GG＝C转换碱基对的转换可由互变异构和化学诱变引发。1.互变异构在DNA分子的四种碱基中，胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)能够酮式或烯醇式出现。胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)能够氨基式或亚氨基式出现。在生物体中，普通以酮式和氨基式构造存在。但在极少数状况下，胸腺嘧啶分子中的N3位上的氢能转移到C4位氧上，使酮式转变为烯醇式，但瞬间即恢复为酮式，这种分子构造上的互变称为互变异构。如果就在变为烯醇式的瞬间，DNA的复制刚好达成这一部位，这时的胸腺嘧啶就不再与腺嘌呤配对，而与鸟瞟岭配对。2.化学诱变剂引发的碱基对置换能够引发DNA分子中碱基对置换的诱变剂诸多，常见的有碱基构造类似物，如亚硝酸、羟胺、烧化剂等。它们可直接或间接地引发DNA分子的碱基对置换。二.移码突变移码突变指DNA分子中增添或缺失少数几个碱基对，而造成其背面全部遗传密码发生转录和翻译错误的基因突变。点突变普通只涉及到一种密码子的变化，而移码突变涉及到了突变点后来全部密码子的变化，因此是一类影响较大的突变。与染色体畸变相比，移码突变仍属于DNA分子的微小损伤。三.染色体畸变由于某些理化因素的作用造成DNA分子的大损伤所引发的突变叫染色体畸变。涉及染色体的缺失、重复、插入、易位和倒位，也涉及染色体数目的变化。染色体构造上的变化可分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。引发染色体畸变的因素诸多，能够自发地进行，也能够诱发进行。亚硝酸等诱发点突变的诱变剂，也可引发染色体畸变。物理诱变剂普通以引发染色体畸变为主。1.紫外线：DNA含有强烈的紫外吸取能力，特别是核酸链上的碱基对。其重要生物学效应是其对DNA的作用，涉及使DNA链断裂、DNA链内或链间交联、嘧啶碱的水合作用及胸腺嘧啶二聚体的形成。2.X射线、γ射线和快中子：X射线、γ射线和快中子等属于电离辐射，穿透力强，碰到原子或分子便产生次级电子，次级电子可产生电离作用。它们的直接效应是碱基间、DNA间、糖与磷酸间的化学键断裂；间接效应是电离作用引发水或有机分子产生自由基作用于DNA分子，造成缺失或其它损伤。3.热：可使胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，从而引发碱基配对错误；还可引发鸟嘌呤脱氧核糖键移动，从而在DNA复制时出现碱基对的错配。4.生物诱变因子：转座因子也是实验室中惯用的诱变因子，它们可在基因组的任何部位插入，引发该基因的失活造成突变。转座因子是细胞中能变化本身位置的一段DNA序列。5.3菌种的选育选种是根据微生物的特性，采用多个分离筛选办法，从自然界中或从生产实践中选出符合人们规定的菌种。育种是根据微生物遗传变异的原理，在已有的菌种基础上，采用诱变或杂交的办法，迫使菌种发生变异，然后在变异的菌株中挑选出符合生产实际规定的菌种。5.3.1从自然界中获得新菌种一.从自然界中选种1.样品采集根据我们的目的到最适宜的地方去采集样品。在这方面，掌握理解微生物的生态知识有助于菌种的筛选。从土壤中采集样品，又称采土。采土的时候，应注意土壤肥瘦、采土深度、采土季节、采土办法。2.增殖培养增殖培养是往样品中加人适合某些微生物生长繁殖的物质，或发明有助于某些微生物生长繁殖的环境条件，这样就增进了某些微生物大量繁殖，如往土样中加入某些石油，能运用石油的微生物容易生长繁殖；把土样加入到含糖浓度高的培养基中，并把pH调到4下列，就可使酵母菌得到增殖。3.分离纯化分离纯化有诸多办法：平板划线分离法、稀释涂布分离法、单孢直接挑取法、菌丝尖端切割法等。4.性能测定性能测定分粗测和精测。粗测又称初筛，重要起定性的作用，普通在培养皿上进行。经初筛后的菌种还要进行精测，才干适合生产的需要。精测又称复筛，普通采用靠近生产工艺条件的三角烧瓶液体进行振荡培养或用台式发酵罐进行发酵，然后测定发酵液，再进行分析比较，最后选出比较抱负的菌种。二.从生产中选种在生产过程中，经常注意那些菌体形态或菌落性状以及某些生理性能上发生自然变异的微生物，将它们挑选出来，进行比较实验，有时能够选出更加抱负的菌种。5.3.2自发突变与定向哺育一.自发突变的因素引发微生物自发突变的因素诸多，重要有下列几方面：DNA复制、微生物本身产生诱变物质、环境对微生物的诱变作用等。二.自发突变的偶然性及其热点S.Luria等人提出突变是一种偶然事件，突变概率很低，这些突变可发生在任一瞬间、任一碱基，这是难以预见的，因此任何时间、任何基因或任一种基因位置都有可能发生突变，这似乎阐明突变是随机的，但有些事实证明突变并非是完全随机的，突变位置也并非是完全随机分布的。发现突变热点和突变频率有某种规律性。所谓突变热点是指同一基因内部突变率特别高的位点。定向育种定向育种是指在某一特定条件下，长久培养某一微生物菌群，通过不停转接传代以积累其自发突变，并最后获得优良菌株的过程。由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，故用此法育种十分缓慢。5.4诱变育种诱变育种是人为的运用物理和化学等因素，使诱变的细胞内遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或DNA的某一部位发生变化(又称为点突变)，从而使微生物的遗传物质DNA和RNA的化学构造发生变化，引发微生物的遗传变异，然后设法从群体中选出少数优良性状的菌株，以供科学实验或生产实践中使用。5.4.1物理诱变一.紫外线(UV)诱变DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸取能力，最大的吸取峰在260nm。对于紫外的作用已有多个解释，但研究的比较清晰的一种作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体，妨碍碱基正常配对，并可能引发突变或死亡。另外嘧啶二聚体的形成，还会妨碍双链的解开，影响DNA的复制和转录。二.激光诱变激光辐射能够通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合作用，直接或间接地影响生物有机体，引发细胞DNA或RNA、质粒、染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的变化。不同种类的激光辐射生物有机体，所体现出的细胞学和遗传学变化也不同。三.离子束注入诱变通过对人们所但愿的离子进行加速，从而对细胞进行刻蚀加工。注入细胞内部的离子可对部分基因进行修饰、加工、引导外源基因，特别是大分子基因组转入受体细胞，实现在新遗传背景下的诱变育种及遗传转化。四.徽波辐射诱变微波能够透射到生物组织内部，使偶极分子和蛋白质的极性侧链以极高的频率振荡，增加分子的运动，造成热量的产生。微波还能够对氢键、疏水键和范德华力产生作用，使其重新分派，从而变化蛋白质的构象与活性。五.空间诱变高空诱变就是运用高空探测气球搭载微生物，通过大气的平流层或电离层的电离辐射而诱发细胞变异。5.4.2化学诱变化学诱变就是运用化学诱变剂解决分散均匀的微生物细胞群，以引发碱基置换、染色体断裂、基因重组或基因突变等生物学效应，使后裔产生变异。然后采用简便、快速、简朴的筛选办法，可筛选符合育种目的的菌株，以供生产实践或科学研究用。化学诱变剂是靠各自的活性基团，靠它们特有的化学特性直接与生物分子进行多个特定的化学反映，从而引发生物分子化学性质的变化。化学诱变剂的种类诸多，根据它们对DNA的作用机制，能够分为三大类：第一类是烷化剂，它与一种或多个核酸碱基起化学变化，因而引发DNA复制时碱基配对的转换而发生变异。例如硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亚硝基胍、亚硝基甲基脲等。第二类是某些碱基类似物，它们通过代谢作用渗入到DNA分子中而引发变异，例如

5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤等。第三类是吖啶类，它造成DNA分子增加或减少一、二个碱基，从而引发碱基突变点下列全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。5.5基因重组将两个不同性状个体内的基因通过一定途径转移到一起，通过遗传分子间的重新组合，形成新的遗传型个体的过程称为基因重组或遗传重组。5.5.1原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组形式诸多，机制较远时，其特点是①片段性，仅一小段DNA序列参加重组；②单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；③转移机制独特而多样，基因重组的方式重要有转化、转导、接合和原生质体融合几个形式。5.5.2真核微生物的基因重组在真核微生物中，基因重组方式诸多，重要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等，其中原生质体融合和遗传转化与原核生物中介绍过的内容基本相似，这里仅介绍有性杂交和准性杂交。一.有性杂交杂交是在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。有性杂交普通指细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后裔的一种育种技术。凡能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和覃菌，原则上都可应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交办法进行育种。二.准性杂交准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种两性生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而造成低频率的基因重组并产生重组子。因此能够认为，准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象。准性生殖常见于某些真菌，特别是尚未发现有性生殖的半知菌类。5.6基因工程基因工程（Geneticengineering）或重组DNA技术(RecombinantDNAtechnology)是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为的办法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和体现，从而获得新物种的一种育种技术。5.6.1基因工程的发展历史微生物育种的实践推动着微生物遗传变异基本理论的研究，而对遗传变异本质的日益进一步研究又大大增进了遗传育种的发展。1927年，发现X射线能诱发生物体突变，后来又发现紫外线等物理因子的诱变作用，于是很快被应用于早期的青霉素生产菌种Penicilliumchrysogenum（产黄青霉）的诱变育种中，并获得了明显成效；1946年，当发现了化学诱变剂的诱变作用，并初步研究了它们的作用规律后，在生产实践中就掀起了运用化学诱变剂进行诱变育种的热潮；几乎在同一时期，由于对真核微生物的有性杂交、准性杂交和原核微生物种种基因重组现象的研究，在育种实践上出现了多个杂交育种新技术；步入20世纪50年代以来，由于对遗传物质的存在形式、转移方式以及构造功效等问题研究，增进了分子遗传学的飞速发展。5.6.2基因工程的重要过程基因工程技术涉及以下环节：目的基因（即外源基因或供体基因）的获取，普通涉及DNA的纯化技术、酶促消化或机械切割、以游离目的DNA序列；载体系统的选择，对细菌细胞来说，适宜的克隆载体有质粒和细菌噬菌体；目的基因与克隆载体的连接，形成重组体；将重组DNA分子转到适宜的宿主中，如大肠杆菌，当运用质粒时，对一重组的病菌载体来说此过程又称为转化或转染；“工程菌”或“工程细胞株”的体现、监测及实验室和一系列生产性实验等，运用细胞培养技术，培养筛选转化的细胞，一种转化的宿主细胞能生长并产生遗传上相似的克隆细胞，每个细胞都携带着转化的目的基因。图5-5基因工程的重要原理与操作环节示意图5.6.3基因工程的应用基因工程正在或即将使人们的某些梦想和但愿变成现实。基因工程广泛应用于工业、食品、农业、医疗、采矿、冶炼、材料、能源、环保和生物学基本理论的研究，带动了生物技术的高速发展。重要的应用有：基因工程药品、转基因植物和转基因动物、改造传统工业发酵菌种、基因治疗、基因工程在微生物研究中的应用、基因工程在环保中的应用等。5.6.4基因工程研究展望基因工程的兴起造成生物科学发生了深刻的变化，重要体现引发了生物科学中技术上的创新和迅猛发展；技术上的重大突破，促使生物科学获得前所未有的高速发展；为改造生物提供强有力的手段，使生物学进入发明性的新时期。5.7菌种保藏与灭菌5.7.1菌种的退化和防治一.菌种退化生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失称为菌种退化。菌种退化能够是形态上的，也能够是生理上的，具体体现有①菌落和细胞形态的变化；②生长速度缓慢，产孢子越来越少；③代谢产物生产能力地下降；④致病菌对宿主侵染力的下降，⑤抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温、抗高温等）能力的削弱等。二.菌种退化的因素1.基因突变菌种退化的重要因素就是那些控制生产性状的基因发生负突变。退化性变异是大量存在的，而进化性变异则是个别的。2.分离现象遗传育种获得的菌种若是多核（或是单核）但DNA双链之一发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。这种退化不是基因突变引发的，而是由于诱变获得的高产株本身不纯。三.菌种退化的防治1.从菌种选育时考虑在育种过程中，应尽量使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行解决，采用较高剂量使单链突变的同时，另一条单链丧失了模板作用，能够减少出现分离回复现象；同时，在诱变解决后应进行充足的后培养及分离纯化，以确保获得菌株的“纯度”。2.从菌种保藏角度考虑不管在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种可传代次数。斜面保藏的时间较短，只能作为转接和短期保藏的种子用，应当在采用斜面保藏的同时，采用沙土管、冻干管和液氮管等能长久保藏的手段。3.从菌种培养的角度考虑多个生产菌对培养条件的规定和敏感性不同，培养条件要有助于生产菌株，不利于退化菌株的生长。4.从菌种管理的角度考虑菌种复壮就是在菌种发生退化后，通过纯种分离和性能测定，从退化的群体中找出尚未退化的个体，以达成恢复该菌种原有性状的一种方法，但这是一种消极的方法。5.7.2菌种保藏的原理和办法一.定时移植保藏法将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基，也可进行穿刺培养，待生长成强健的菌体（对数期细胞、有性孢子或无性孢子）后，将菌种放置4℃冰箱保藏，每间隔一定时间需重新移植培养一次。二.液体石蜡保藏法在生长良好的斜面表面覆盖一层无菌的液