有机阳离子转运体的研究进展

有机阳离子转运体的研究进展

在人体的内外环境中，有各种外源性材料及其代谢产物。对于这些物质的去除，有许多机制可以例如使用代谢酶和转化体来代谢或排泄。Solutecarrier(SLC)超家族是目前发现的最大的转运体超家族,在人类为SLC21和SLC222个家族,介导不同有机阳离子、阴离子和其他化合物的转运。SLC21有9个成员,转运分子质量较大的有机阴离子或两性化合物,包括胆汁酸盐、类花生酸类物质、类固醇激素以及它们的轭合物。而SLC22家族目前发现有12个成员(人类和老鼠),包括有机阳离子转运体家族(organiccationtransporters,OCTs),肉毒碱转运体(OCTN2/SLC22A5)、尿酸盐阴离子交换转运体(URAT1/SLC22A12),以及个别的有机阴离子转运体。有机阳离子转运体家族有3个成员,分别是OCT1,OCT2和OCT3。在人类OCT1主要表达于肝脏,而OCT2主要表达于肾脏,与前两者主要表达于排泄器官不同,OCT3在人类大脑皮质和心脏含量高。由于它们的表达部位不同,故在内外源性物质转运中发挥着不同的功能。OCT1的主要作用为把外源性物质转运进入肝细胞进行代谢,OCT2主要是将血液中的有机阳离子物质转运进入肾脏进行排泄,而OCT3与一些有机阳离子药物进入大脑发挥作用有关。本文仅对OCT1的生理和药理作用进行综述。1总线的结构和功能1.1细胞外tmdOCTs家族的第一成员OCT1于1994年在小鼠肾脏克隆表达。rOCT1基因编码556个氨基酸的蛋白质,二级结构含有12个跨膜区(transmembranedomain,TMD),它包含一个巨大的细胞外袢,这个外袢位于第一和第二个TMD之间,有3个N-偶连的糖基化位点,可能与蛋白质的稳定性、细胞内的信号转导或保护细胞免受外周蛋白酶的溶解有关。1.2ct1的底物OCT1是一个内向转运体,最初发现rOCT1的功能特征与先前报道的位于肾小管细胞和肝细胞基底膜对有机阳离子的转运过程相似,主要将血液中的有机阳离子底物或药物转运进入肝细胞进行代谢或排泄,具体机制不详。OCT1的底物很多,一般情况下,介导60~350D(1D=1u)的小分子亲水性化合物的内向转运,这些化合物在生理环境下,至少含有一个正电荷。尽管许多化合物抑制或调节OCT1的转运活性,但它们并不都是OCT1的底物。OCT1的底物有:四乙胺(tetraethylammonium,TEA),1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+),临床药物如抗震颤麻痹药(金刚烷胺、美金刚),黄酮类化合物、降糖药(苯乙双胍、二甲双胍)、H2受体拮抗剂、生物胺(多巴胺、去甲肾上腺素)以及一些内源性化合物(胆碱、胆酐)。此外,研究发现hOCT1还介导了阴离子前列腺素的转运。2hoct1的mrna表达采用Northern分析和RNA原位杂交显示,rOCT在肝脏、肾脏以及小肠细胞均有表达。人类hOCT1主要在肝脏表达,Zhang等在人类小肠也发现了hOCT1mRNA的表达,但是hOCT1在肠道细胞转运过程中发挥的作用不详。采用免疫组织化学分析OCT1的组织分布和亚细胞定位,结果表明,在肝脏,rOCT位于肝小叶中央静脉周围的肝细胞窦状隙膜;在肾脏,rOCT位于近曲小管及皮质部,在髓质部分布很少。而采用Western技术分离离体的近端小管细胞基底膜和刷状膜,显示rOCT位于基底膜。3由于华侨1基因的多态性和功能，以3.1突变snps的表达OCT1的多个SNPs的等位基因频率存在种族差异。Kerb等发现了OCT1的25个SNPs,其中包括8个非同义突变,并且有3个非同义突变使OCT1的转运活性下降。Shu等从5个不同的种族中发现15个SNPs,以MPP+为底物检测了这些多态性对其功能的影响,有5种突变使其转运活性减弱或丧失。Masaya等在日本人群中也发现了15个SNPs,其中有8个与Kerb等的发现相同,有7个是新发现的突变。上述8个SNPs在白种人和日本人中的频率有所不同,IVS1-43T>G(白种人0.085,日本人0.629);480C>G(Phe160Leu)(白种人0.216,日本人0.086);IVS2+97G>A(白种人0.052,日本人0.457);IVS10-21C>T(白种人0.228,日本人0.591)。另外,181C>T(Arg61Cys)、262T>C(Cys88Arg)及17857G>A(Gly401Ser)3种SNPs仅在白种人中发现,频率分别为9.10%,0.60%及3.20%。而953C>T(Pro283-Leu)和964C>G(Arg287Gly)首次在日本人中检获,尚未在白种人中发现。3.2推进多元转导剂对犯罪pa的表达,主要表现为功能、表型的突变OCT1基因多态性与其表型之间的关系还不清楚,但是OCT1的某些SNPs与其功能的下降或增强有关,进而影响其底物药物的药动学。Jonker等研究报道,OCT1基因敲除小鼠肝脏中二甲双胍(OCT1的一个底物药物)的分布和抗癌药间碘苯甲胍的蓄积减少有关。因此,基因突变引起的OCT1转运功能的改变是否会引起相似药动学效率将是一个值得研究的问题,这不仅有助于了解某些阳离子药物在体内蓄积的个体差异的原因,而且有助于了解某些疾病的进程。然而,确定哪一种SNPs对其功能或表型的影响更大又是一个新的重要问题。Shu等采用氨基酸测序系统检测到了引起OCT1的15种蛋白质转变的基因突变,而发生有功能意义的突变之后,转运蛋白的理化性质的改变更大。文献报道,以[3H+]MPP、[14C]TEA及[3H+]5-羟色胺为底物来检测OCT1各种SNPs对其转运活性的影响,发现Arg61Cys,Phe160Leu以及Met420del对OCT1的转运功能以及对底物的亲和力没有显著影响。与野生型相比Cys88Arg和Gly401Ser使OCT1对[14C]TEA和[3H+]5-羟色胺转运的减弱程度远远高于对[3H+]MPP转运减弱的程度,可见二者对不同底物的特异性不同。而Arg61Cys使OCT1对MPP的转运减少了70%;Cys88Arg和Gly401Ser突变者,OCT1对MPP的转运减少了98%以上。Sakata等研究发现,与野生型相比,表达OCT1Pro283Leu和Arg287Gly的爪蟾卵母细胞对[3H]MPP和[14C]TEA转运活性完全丧失;而表达P341L的细胞对[14C]TEA的转运减少到65.1%。另外,Shu等报道,Ser14Phe导致OCT1对MPP的转运增强。目前,对这些突变的功能意义的研究都集中于体外细胞水平,其在体内的功能意义还需进一步的研究。4配合侯化活性4.1细胞的药物转运和机转学在rOCT-HEK293细胞的培养液中加入腺苷酸环化酶激活剂福斯高林(血小板抗凝剂)或膜通透性甘油二脂类似物(sn-1,2-dioctanoylglycerol,DOG),之后,rOCT-HEK293细胞对4-(4-(二甲氨基)苯乙烯基)-N-甲基吡啶酮碘化物(4-(4-(dime-thylamino)styryl)-N-methylpyridiniumiodide,ASP+)转运的起始速率和最大转运浓度均有所增加,而在HEK293细胞的培养体系中加入福斯高林前后对ASP+的转运没有明显的变化。福斯高林和DOG对ASP+转运活性的刺激可分别被蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)的抑制剂KT5720和蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)的特异性抑制剂他莫西芬完全拮抗。提示OCT1对有机阳离子的转运可以被PKA或PKC的激活剂所增强。4.2roct1-hek293细胞的内转和内转的特性体外电流钳实验显示,胆碱(有机阳离子)可以将表达有rOCT1的爪蟾卵母细胞去极化,增加细胞外的K+浓度可改变rOCT1的爪蟾卵母细胞的膜静息电位,并可使胆碱引起的去极化降低26%;相反,细胞外K+浓度的增加并不能改变胆碱引起的处于-50mV的爪蟾卵母细胞内向电流的大小。而当电压去极化到0mV时,胆碱所介导的内向电流下降了50%。这些结果表明,膜电压可影响胆碱的内向转运,但这并不是唯一的驱动力。Mehrens等检测了rOCT1-HEK293细胞内向转运ASP+时的膜电压变化,将细胞外的K+浓度从3.6mmol/L逐渐增加到145mmol/L使细胞去极化,再用等摩尔的Na+来复极化。细胞外的这种K+浓度梯度变化,使rOCT1-HEK293细胞的膜电压逐渐下降。13次重复实验发现,当K+浓度增加到50mmol/L时,ASP+内向转运的起始速率下降约36%,而细胞内ASP+的浓度下降了约50%。6次重复实验发现,当K+浓度增加到145mmol/L时,ASP+内向转运的起始速率下降73%以上,而细胞内ASP+的浓度下降超过87%。可见膜电压对有机阳离子的转运有很大的影响,但具体机制有待于进一步的研究。5由于每种药物的替代动力学的作用和临床意义5.1对雷尼替丁的汲取H2受体拮抗剂(如雷尼替丁和法莫替丁)是经典的弱亲水化合物,在生理pH环境下以有机阳离子的形式存在于血液中。它们在人体口服吸收良好,生物利用度为40%~70%,个体差异较大。研究报道,雷尼替丁既是OCT1的底物又是其抑制剂。体外实验证实,与空白细胞相比,表达了hOCT1的爪蟾卵母细胞对雷尼替丁的摄取增强了50倍。Caco-2细胞对雷尼替丁的摄取具有饱和性、跨膜电位差依赖性,可以被OCT1的经典底物TEA+和MPP+所抑制,并且随着培养液中TEA+,MPP+及法莫替丁浓度的增加hOCT1-Caco-2细胞对雷尼替丁的摄取逐渐减少,可见,它们相互竞争转运体。肝脏对雷尼替丁、法莫替丁的代谢不起主要作用。由于hOCT1对雷尼替丁摄取的km值为70μm,故正常治疗剂量下,肝脏对其摄取不会达到饱和,雷尼替丁很少从胆汁中排泄,小于口服剂量的2.6%。而不被代谢的雷尼替丁被转运回血液之前会在肝细胞中蓄积,引起一过性药物或中毒性肝损害,使ALT从肝细胞释放入血,这可能是雷尼替丁在部分患者引起血清ALT暂时性升高的一个原因。5.2奥沙利铂的选择性尽管铂类金属抗癌药物如顺铂、卡铂及奥沙利铂具有相似的DNA结合特性,但只有奥沙利铂对直结肠肿瘤有效。铂类化合物对这类肿瘤特异性作用的机制目前仍不清楚。研究发现有机阳离子转运蛋白OCT1可以显著增加奥沙利铂在转染细胞中的蓄积及毒性,但对顺铂及卡铂则无此作用,提示奥沙利铂可能是这类运载体的合适底物。奥沙利铂对6种结肠癌细胞细胞株的毒性高于顺铂,但合用OCT1抑制剂西米替丁后,这种毒性作用下降,与顺铂相似,甚至低于顺铂。提示OCT1为奥沙利铂抗癌活性的一个决定因素,亦与其抗肿瘤特异性有关。5.3甲双醚和tc1对一般降糖作用的影响二甲双胍是临床治疗2型糖尿病应用很广的处方药,OCT1及其基因多态性对二甲双胍疗效有重要的影响。OCT1在肝细胞对二甲双胍摄取的过程中发挥着极其重要的作用。二甲双胍的疗效与AMP激活的蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)的活化有关,OCT1在其中的作用还不清楚。在OCT1敲除的小鼠,二甲双胍对AMPK的磷酸化以及糖原异生的影响减弱,甚至完全丧失二甲双胍的降糖作用。而OCT1-420del对二甲双胍的转运活性下降。临床实验研究发现,携带使OCT1活性下降或消失的多态性个体,二甲双胍在糖耐量试验所发挥的作用明显降低。6药物间相互作用hOCT1是分布在人类