植物细胞凋亡的形态学变化及其机制

植物细胞凋亡的形态学变化及其机制

细胞死亡是指多细胞生物在发育过程中或因某些环境因素而发生的、积极死亡的方式。它对于生物体的正常发育、自稳平衡及多种病理过程具有极其重要的意义。细胞凋亡的概念由Kerr于1972年提出,当时用来描述某些类型细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,主动地结束其生命,最终脱落离体或裂解为若干凋亡小体而被其它细胞所吞噬的过程。细胞凋亡的主要特征包括:染色质凝集、质膜出芽、核裂解及凋亡小体的形成。在植物的发育过程和防御机制中,由基因控制的细胞凋亡也发挥着重要作用。近年来,越来越多的证据表明,无论是在植物的生长发育过程(包括根冠细胞、导管分子、绒毡层细胞、大孢子细胞等),还是在超敏反应(hypersensitivereaction)中,都普遍存在着细胞凋亡现象。其中,管状分子(如导管和筛管)的研究一直是关注的重点。导管和筛管是植物体内输导组织的主要成分,负责水分、无机盐和有机物质的输送。有关导管和筛管发育的形态学资料非常丰富,尤其是导管,已经成为研究植物细胞凋亡的模式材料。目前已经分离了2个编码半胱氨酸蛋白酶的cDNAs、p48h-17和ZCP4,以及与DNA断裂有关的核酸酶的cDNA克隆BEN1和ZEN1。可以说,导管细胞凋亡的证据已经非常充分,但其信号传导通路正在研究中。有关筛管细胞凋亡的探讨目前仅停留在形态学观察上,虽然筛管的发育过程呈现了细胞凋亡的典型特征,如染色质凝集和边缘化、核膜破毁、大量膜泡出现等,但少量细胞质(线粒体和质体)的保留体现了筛管的发育不同于导管,具有其特有的凋亡途径。导管和筛管的不同凋亡途径与其所执行的生理功能密切相关,了解和研究管状分子分化过程中的细胞凋亡现象及其信号传导途径对进一步阐明细胞凋亡的机制以及在发育生物学中的作用具有非常重要的意义。本文对植物细胞凋亡的形态特征和机制进行综述,着重阐述管状分子发育中细胞凋亡的研究现状和进展,并对两种管状分子(导管、筛管)的凋亡机制进行探讨,为进一步阐明植物细胞凋亡的机制提供理论基础。1植物细胞凋亡动物细胞凋亡的形态特征包括以下3个细胞学标准:(1)核内DNA断裂和染色质的凝集;(2)出现凋亡小体;(3)凋亡小体的吞噬。植物细胞凋亡的形态有部分与动物相似,如细胞核和细胞质的凝集和固缩,核内DNA的片断化通常可以显示TUNEL阳性反应和DNA梯状条带(DNAladder)等。但这3条标准并不能完全反映植物中的细胞死亡现象,如植物细胞中鲜有凋亡小体发现。在铝诱导的大麦根冠细胞的死亡以及导管发育过程中,均未发现凋亡小体的形成。植物与动物细胞凋亡最明显的不同在于细胞死亡后产物的去向,动物中都是被邻近的细胞所吞噬,植物的机制可能涉及细胞自溶,或者用于本身细胞壁的构建。总之,植物细胞凋亡具有染色质固缩和边缘化、DNA片断化、核的降解、细胞质的改变包括质膜内缩、大量囊泡的出现、细胞壁的修饰等特征。2细胞凋亡parp和细胞色素c动物细胞中的凋亡通路是一个复杂的过程,简单说有两种主要途径。一种是细胞表面死亡受体接受死亡信号后形成死亡诱导信号复合物,而使细胞凋亡的起始者(caspase2,8,9,10)活化,再激活下游的执行者(caspase3,6,7),从而执行对死亡底物的酶解;另一种与线粒体中细胞色素C有关,细胞色素C从线粒体到胞质的释放是通过Bcl-2蛋白家族调控的。释放的细胞色素C与胞质中的dATP和Apaf-1结合,诱导caspase9的活化,从而引起细胞内关键底物的裂解(如PARP),直接导致上述细胞凋亡形态学的变化(图1)。植物细胞凋亡机制的研究起步较晚,虽然与动物细胞凋亡相比具有一定的相似性,但是许多证据表明,植物细胞凋亡的相关基因和蛋白质序列与动物细胞相比,只存在部分同源性,这也是目前植物细胞凋亡机制研究的热点。关于植物细胞凋亡机制的研究现状可以归纳为以下两个方面。2.1植物细胞中caspase的结构及功能变化动物细胞的凋亡是由一系列特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)调控的,已有证据表明植物细胞凋亡过程中也发生类似caspase的活化。Olga等用caspase特异性抑制剂Ac-YVAD-CMK(caspase-1抑制剂)和Ac-DEVD-CHO(caspase-3抑制剂)消除了烟草的细胞凋亡,第一次在细菌诱导的烟草细胞中检测到类似caspase的活性,表明caspase的活化对细胞死亡起了重要的作用。Anke等在化学物质喜树碱、星形孢菌素、串珠镰孢菌素诱导的番茄悬浮细胞凋亡中也发现了caspase-1和3的活性。植物细胞中有两类caspase:液泡处理酶(VPE)和准半胱氨酸蛋白酶(metacaspase),这两种蛋白酶的序列和三级结构与动物的caspase有关,并且具有caspase活性,被认为是caspase的同源物。VPE是一种重要的液泡处理酶,它能够激活各种液泡蛋白酶,也能使水解酶活化,从而参与液泡的水解。VPE不仅具有caspase-1的活性,而且它的预测三级结构也与动物的caspase-8类似,可能是植物中“液泡引发凋亡”模式的关键酶。而metacaspase在系统发生上则具有与caspase更近的同源性,根据其序列和结构特征又分为两种类型:Ⅰ型metacaspases含有富含脯氨酸和锌指结构的原结构域,与植物HR蛋白LSD1相似;Ⅱ型metacaspase没有明显的原结构域,但是在caspasep20和caspasep10亚基的中间区域具有一段180个氨基酸的保守插入序列。Frank等利用BLAST分析鉴定了番茄细胞中存在Ⅱ型metacaspaseLeMCA1,并且发现在真菌诱导的番茄叶片细胞凋亡过程中,LeMCA1mRNA的含量显著增加。而在植物胚胎发生的末期,分化细胞中的metacaspasemcⅡ-Pa从细胞质转移到细胞核,并位于核孔复合体和染色体上,引起核膜解体和DNA片断化,说明mcⅡ-Pa是胚胎发育过程中细胞凋亡的关键执行者。而Moonil等用26S蛋白酶基因沉默的方法诱导烟草细胞凋亡时发现,细胞不仅呈现了核凝集、DNA片断化、活性氧分子大量产生等典型的细胞凋亡特征,而且还检测到了类似caspase-3和caspase-9的活性,以及线粒体膜势下降的现象。此外,除了VPE和metacaspase外,丝氨酸蛋白酶也呈现了caspase活性,可能在植物细胞凋亡过程中发挥着重要作用。2.2细胞色素c从土地释放到胞质动物细胞凋亡过程中,细胞色素C由线粒体向细胞质中释放,是caspase-3活化的必要条件。近年来,人们发现在凋亡诱导因子作用下,植物的线粒体也能释放出细胞色素C,表明这条死亡途径在进化过程中是保守的。Sun等首次利用无细胞体系,在甲萘醌诱导的烟草原质体凋亡过程中,发现细胞色素C从线粒体释放到胞质中。他们用含有线粒体或细胞色素C的烟草细胞质抽提物成功诱导了小鼠肝细胞核的凋亡以及PARP的降解;而当烟草细胞质抽提物中不含有线粒体时,甲萘醌则不能诱导小鼠肝细胞核的凋亡。这说明,细胞色素C从线粒体到细胞质中的释放是植物细胞凋亡的必经之路。之后,Balk等也发现55℃热处理后的黄瓜子叶细胞凋亡过程中,细胞色素C从线粒体释放到胞质中。细胞色素C从线粒体释放到胞质中对于植物细胞凋亡有着重要作用,也证明了植物细胞凋亡过程中细胞色素C角色的保守性。3细胞凋亡的分子鉴定植物体的整个发育过程中许多细胞都发生凋亡,它们的凋亡对植物的发育具有不可替代的重要意义。细胞凋亡最好的例证就是植物体中运输水分、无机盐和有机物质的管状分子的发育成熟过程。有关导管分子分化过程中细胞凋亡的研究工作已很多,并鉴定出了与其DNA断裂有关的DNase及其基因BEN1和ZEN1,此外,在百日菊叶肉培养系统中还克隆了管状分子分化中特异表达的TED1至TED4等基因,说明这些基因都参与了木质部分子分化中细胞凋亡的调控。筛管分子成熟后成为无核的半死状态的细胞,越来越多的形态学证据(如细胞核降解、染色质凝集等)已证明,筛管也已经具备了细胞凋亡的基本形态特征,但目前仍缺乏分子学佐证。值得注意的是,管状分子如导管、筛管在其发育、分化和执行生理功能中所特有的凋亡过程虽然有其共同的特点,但在超微结构和凋亡机制等方面存在一定的差异。3.1成熟导管丧失原理植物细胞凋亡的最典型例子就是木质部导管分子的分化。导管分子是木质部的典型细胞,成熟导管丧失了核和细胞内容物,只剩下一个中空的管道。从分生组织到成熟导管,导管的分化经历了原形成层起始物、原形成层、不成熟的导管和导管前体4个阶段,细胞凋亡发生在导管成熟阶段。3.1.1细胞破壁与细胞外细胞的降解在原生木质部形成过程中,导管细胞经历了形态和生理变化。首先,随着原形成层的分生组织细胞的伸长,细胞壁形成环纹、螺纹或网纹的加厚。在次生壁加厚的同时,细胞骨架发生重排,高尔基体增多。随后细胞开始自溶,大量细胞内容物,包括质体、高尔基体、线粒体、微管、核糖体、溶酶体、质膜以及细胞核等都随着液泡的裂解而消失。在导管细胞的分化过程中,细胞核的结构和DNA含量均发生明显变化。在早期,细胞核体积膨大,DNA含量增加;当次生壁形成以后,细胞核体积开始缩小,并且出现一些结构变化,包括形成叶状突起、染色质凝集等;最后,核仁消失,核质不易被着色。Mittler等利用DNA断裂原位杂交的方法,证明在导管细胞核解体之前,核内DNA发生断裂,且证明DNA的降解发生在细胞核破裂之前,表明核酸内切酶活化的机制可能导致了植物细胞核内DNA的降解。另外,细胞降解过程中细胞质出现球状小体,将细胞质成分运送到液泡中降解。该过程与动物细胞凋亡小体形成过程相似,唯一不同的是动物细胞的凋亡小体通过质膜出芽,最终被邻近细胞所吞噬,而不是进入液泡中降解。体外培养的导管细胞与植物体内木质部的导管分子的细胞凋亡不尽相同,并无球状小体的出现。在体外培养的百日菊细胞中,所有细胞器包括核的降解,都发生在液泡裂解之后,说明液泡破裂是细胞器降解的最早标志。液泡裂解后,单膜细胞器,如内质网、高尔基体首先发生末端膨胀,变成气球状结构,然后消失。不久双层膜细胞器如叶绿体、线粒体开始降解,先是基质,然后是膜。荧光染色结果表明在液泡破裂后10~20min内,细胞核迅速降解,没有染色质凝集和DNA断裂现象出现,且叶绿体中的核酸与细胞核中的核酸几乎同时降解。无论是体外培养的导管细胞还是木质部的导管,液泡在分化过程中都起着举足轻重的作用,类似于动物细胞的溶酶体。这也是植物细胞凋亡不同于动物细胞凋亡的显著特征。3.1.2液泡裂解前细胞的活性与动物细胞凋亡不同,导管具有其独特的凋亡模式。导管细胞凋亡最明显的特征就是中央大液泡的迅速裂解释放出多种蛋白酶和核酸酶,导致各种细胞器,包括细胞核的最终降解(图2)。对百日菊细胞的显微观察表明,导管分化过程中,先发生次生壁的加厚,然后出现液泡裂解,之后细胞内容物消失。在次生壁加厚的过程中,胞质仍然流动,液泡裂解的同时,胞质停止流动,表明液泡裂解前细胞仍然具有活性。导管细胞凋亡涉及2种酶参与。一方面,液泡裂解导致最适pH为酸性水解酶(包括核酸酶和蛋白酶)的释放,去攻击各种细胞器。ZEN1是一种S1型Zn2+依赖的核酸酶,是第一个被分离和鉴定的液泡酶,对核DNA降解起着主要作用。ZENl是一个43kD的核酸酶,由303个氨基酸残基组成,推测含有1个25个氨基酸残基的信号肽,酸性pH条件下可促进ZEN1的活性。大麦液泡中的天冬氨酸蛋白酶(phytepsin)以及类似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶也在导管形成过程中高度表达,且也有酸性的pH。这些结果表明,液泡通过积累多种凋亡特异性的酸性水解酶来行使其裂解功能,类似于动物细胞凋亡中溶酶体的作用。除此之外,在液泡裂解所引发的细胞自溶之前,细胞质中还存在另外一个与中性pH丝氨酸蛋白酶相关的凋亡途径。3.2筛管-伴胞复合体的运输路线筛管是由许多筛管分子(筛管细胞、筛管节)上下连接形成的管状结构,是同化物运输的主要通道。筛管分子是活细胞,旁边具有与之同源的伴胞,伴胞有核,细胞质浓厚,具有全套的细胞器,与筛管细胞配对存在,组成筛管-伴胞复合体(sieve-element-companion,SE-CC),它们之间通过胞间连丝进行各种物质包括代谢物和生物大分子的运输。筛管位于同化物装载途径中的关键位置,大部分光合细胞形成的光合产物首先通过胞间连丝进入邻近SE-CC复合体的光合细胞,然后释放到质外体,在进入SE-CC复合体中的伴胞,通过与质子的协同运输,最终进入筛管分子进行长距离运输。早期的筛管超微结构显示,筛管分子发育过程呈现了典型的细胞凋亡现象,但与导管分子不同,成熟的筛管分子保留了少数细胞器,仍具有生理活性。3.2.1甲壳动物分子发育的超微结构变化(1)筛孔形成期k由于筛管承载了很高的水势,这就要求筛管细胞壁必须经过一定的修饰才能避免爆裂。在筛分子分化早期,细胞膜附近出现大量与细胞纵轴呈一定角度的微管,纤维素维纤丝被微管环绕,形成筒-环结构。随着筛分子的成熟,微管逐渐降解,最后完全消失。此外,筛分子成熟的重要标志之一是筛孔的形成。筛孔的形成与胼胝质的沉积有关,但发育成熟时,沉积在端壁上的胼胝质被降解,形成中空的孔道,即筛孔。(2)筛管分子早期分化和功能发挥着作用在筛管分子发育过程中,细胞核、液泡、粗面内质网、高尔基体等逐渐被降解,形成一个近中空的管道。首先细胞核作为有界膜的实体消失了,因此筛管分子失去了生长、转化和分裂的能力。1986年,E1eftherious以小麦根尖为材料,研究原生韧皮部筛管细胞的分化过程中,首次报道了细胞核的解体过程,即随着筛管细胞的伸长,细胞核纵向拉伸,染色质在核的边缘聚集,并形成高电子密度的团块,在染色质聚集部位的外层核膜膨大,核间隙明显增大,最后细胞核形成叶状突起,连同包在其中的染色质团块与细胞核主体分离。这一过程与动物细胞凋亡的过程颇为类似。吴鸿等观察了拟南芥根原生韧皮部筛管分子在发育过程中的超微结构变化,结果表明,细胞核具有细胞凋亡的典型特征:出现核膜内陷、核质聚集并边缘化、核膜破毁以及最后核消失。内质网失去核糖体成为特殊的筛管内质网(sieveelementreticulum,SER),并聚集成堆,当筛管分子成熟时,只在细胞周围有少量的内质网存在。SER也是筛管分子成熟的重要标志之一,SER的作用目前尚不清楚,但有证据表明,在液泡裂解以后,SER可以作为贮藏Ca2+的场所。液泡在发育后期也发生降解,释放出各种蛋白水解酶,这些水解酶可能与细胞器的降解有关,但蛋白酶的选择性水解机制至今还不清楚。虽然大多数细胞器在筛管分化过程都消失了,但仍有少量细胞器如线粒体和质体被保留下来。成熟筛管的质体缺乏类囊体膜,只包含结晶状蛋白质或淀粉粒,这些