甘南藏羊不同种群微卫星dna多态性分析

甘南藏羊不同种群微卫星dna多态性分析

甘南地区是西藏的中心产地之一。西藏是甘南地区牧场养羊业的家庭羊。甘南藏羊属于草地羊，对寒冷环境适应性好。甘南藏羊、塔拉和秋季金是中国藏羊中的三个优秀群体。分布地域不同，外观和生产性能差异很大，但有其自身的特点。总数超过200万人。这是甘南高原人民主要的生产和生活材料。藏羊所在地由于高寒生态条件致使引进羊种及其杂种不能适应,从而没有使藏羊受到所谓“杂交改良”的威胁,而保留了藏羊完整的优良基因库。藏系绵羊是优良的地方品种,是培育绵羊新品种的重要育种素材,有着巨大的开发潜力和广阔的利用前景。目前,随着养羊业的发展,人们逐渐对藏羊优良特性的了解以及藏羊肉产品等日益显示出的市场潜力和竞争力看好,藏羊的研究也开始受到人们的极大关注。但由于藏系绵羊品种资源的保护受到资金、条件、效益等多方面的限制,保护利用力度不够,品种退化严重,藏系绵羊的遗传多样性逐步减少,因此利用微卫星DNA标记技术对甘南藏系绵羊不同生态类群的遗传距离进行准确的测定,评价其遗传多样性,揭示藏系绵羊的进化,了解各群体间的亲缘关系、遗传分化、准确区分类型,为定向培育新品种(系、群),合理开发利用甘南藏系绵羊遗传资源,指导甘南藏系绵羊种质资源的监测和保护工作积累理论数据。1材料和方法1.1新鲜血样的制备本试验采用典型群随机抽样法,从甘南藏羊的中心产区分别采集3个类型藏羊的新鲜血样,EDTA抗凝,-20℃保存备用。每个类型随机采取不少于50个个体的基因组样本,公畜不少于10%,两代或三代内没有血缘关系,外貌特征明显,血样共计191份。本研究所用血样采集地点和样本数量见表1。1.2方法1.2.1提取的胎盘dna基因组DNA提取参考《分子克隆实验指南》(第3版)用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA的方法,稍加改进。1.2.2微卫星标记选择所用8对引物由世界粮农组织(FAO)推荐,可由GenBank查得(表2),由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。1.2.3变性材料560PCR反应体系为20uL,PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,50～60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。用10%的非变性PAGE凝胶进行电泳,然后用银染法进行定影、显色。1.3等位基因频率和等位基因大小范围使用ExcelMicrosatelliteToolkit计算等位基因频率、等位基因大小范围。多态信息含量(PIC)、杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)用Dispan软件计算。2结果与分析2.1琼脂糖凝胶电泳检测结果采用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组DNA,用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1。基因组DNA为一条较为整齐的条带,亮度较好,说明提取的DNA的纯度较高,浓度较大,符合分子生物学试验要求。2.2pcr产物检测2.2.1等位基因差别对琼脂糖凝胶电泳的影响对选取的8个微卫星座位进行PCR扩增,产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图2所示。从图中几乎看不出等位基因之间的差别,这是因为相差碱基数较小,琼脂糖凝胶电泳无法分辨所致。特异PCR产物在琼脂糖凝胶电泳检测时只会看到一条带,根据DNAMarker来判断所扩增产物是否在该微卫星位点的特异性条带区域之内。2.2.2无效等位基因根据等位基因扩增片段的大小判断个体的基因型,分离出1条带的为纯合子,2条带的为杂合子,无条带为无效等位基因。部分微卫星位点PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如下,见图3、图4。从图中可以看出,由于微卫星引物的高度变异性和引物的非特异性扩增,所得到的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图中有一些杂带,但都较少较浅。这是PAGE的分辨率较高所致。2.3群体遗传变化的检测2.3.1明8个微卫星座微信基因检测利用MicrosatelliteToolkit软件计算等位基因频率,结果表明8个微卫星座位在3个绵羊群体中共检测出96个等位基因。平均每个位点检测到等位基因数目为12个,数目最多的位点是OarFCB128为17个,片段范围为107～153bp;最少的位点是MAF70为8个,片段范围为146～172bp。2.3.2群体基因数及多态信息含量由表3可以看出,8个微卫星位点在甘南藏羊3个群体中的平均有效等位基因数、平均多态信息含量及群体平均杂合度分别为9.902、0.876、0.896。2.4不同品种藏羊的聚类分析通过遗传距离分析表明,甘南藏羊3个群体的遗传距离分别为甘加羊和乔科羊之间0.2856,甘加羊和欧拉羊之间0.1982,欧拉羊和乔科羊之间0.1640。本研究运用Dispan软件,采用遗传距离信息分别以NJ和UPGMA法进行聚类分析。结果表明,乔科型藏羊、欧拉型藏羊和甘加型藏羊聚到一起,且欧拉羊和乔科羊的距离最近。聚类结果与品种的地理分布、育成史、外貌特征及文献记录基本符合。3遗传多样性分析甘南高原分布的藏羊主要为草地型,据其地域和特性又分为欧拉型、甘加型和乔科型3个亚型,是甘南州草地养羊业的当家羊种,对高寒环境具有良好的适应能力。是在高原条件下经过长期的自然和人工选择形成的藏羊种群,成为我国绵羊遗传资源的宝贵材料。近年来,随着养羊业的发展和地方畜禽品种资源开发利用措施的实施,以及动物种质资源保存战略的推行,发掘和开发利用地方畜禽良种有利于我国畜牧业的持续发展。甘南藏羊资源的保护和选育提高刻不容缓。就家养动物的许多品种采用共同的遗传标记进行测定,同基因的差别可以找出品种的基因流向,这方面的研究,即系统的研究。首先,它是资源评价的基础,因其可以确定品种范围,判定品种归属性;其次,它可以估计某些基因资源在特定品种或群体中潜在分布的可能性,以便制定保持或发展品种特性的规划。对一个品种从外型到基因遗传结构的分析,有利于综合对其进行评价,以便为遗传资源的保护提供可靠的依据。研究中所选择的微卫星位点要求尽可能地分布在各个染色体上,位点的选择还考虑等位基因数目的多少,这样就有可能提供更多的遗传信息。每个位点的等位基因至少在4个以上才能较好地进行遗传分析,一般选择等位基因数在5～19个的为宜,等位基因数太少,不能提供足够的信息量,为以后的分析带来不便。而多态信息含量(PIC)大于0.7的微卫星位点为最好的遗传标记,因为这种情况下,双亲在该位点通常是杂合的,在其后代中可以观察到等位基因分离。另外,扩增产物的片断大小应在100～300bp之间,片段太大,不容易获得扩增产物;太小,不利于结果的统计分析。本研究参考联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的引物,选取了其中8个微卫星引物,结果表明8个微卫星座位在甘南藏羊3个绵羊群体中共检测出96个等位基因。平均每个位点检测到等位基因数目为12个,因此所选微卫星位点多态性较好,可以用于甘南藏羊的遗传多样性评价。等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、杂合度(H)和多态信息含量(PIC)等参数是描述群体内遗传变异的重要指标。等位基因频率是衡量动物群体遗传结构的主要指标之一,是估计和比较遗传变异的第一步。H和PIC都是群体内遗传变异的测度,其值的高低反映了群体内个体的均匀度,若数值高,表明遗传变异大,选择潜力大;反之则群体的遗传变异就小,选择潜力小。从保种的角度来考虑,要保持品种的遗传多样性,只有PIC和H数值大,才能说明群体遗传多样性比较丰富。孙飞舟对多态信息含量和遗传杂合度做了Spearman相关分析,发现这两个指标的相关关系极显著(r=0.9938,P<0.0001),同时指出,这两个指标只要计算其中一个就可以大致反映群体的变异情况。根据等位基因频率的计算表明,结果显示8个微卫星座位在3个绵羊群体中共检测出96个等位基因。平均每个位点检测到等位基因数目为12个,数目最多的位点是OarFCB128为17个,片段范围为107～153bp;最少的位点是MAF70为8个,片段范围为146～172bp。多态信息含量(PIC)是衡量片段多态性的指标。Botstein等首先提出了用多态信息含量(PIC)衡量基因变异程度:当PIC>0.5时,该位点为高度的多态位点;当0.25<PIC<0.5时为中度多态性位点;当PIC<0.25时,为低度多态位点。在所检测的8个微卫星座位中,BM6506位点的多态信息含量最高,为0.898,最低的是MAF70位点,为0.85。所选位点均为高度多态位点,说明所选的8个微卫星位点可以很好地用来做绵羊群体的遗传多样性分析。所研究的甘南藏羊3个群体15个微卫星座位的平均多态信息含量为0.876。表明本研究群体提供的遗传信息较高,具有较大的利用潜力。本研究藏羊群体内微卫星座位之间的差异,如欧拉羊BM6506位点的多态信息含量为0.881,而OarHH35位点为0.868,这种差异可能是该类群在长期的自然和人工选择过程中,不同微卫星座位所受的选择压的差异造成的。基因杂合度(H)又称基因多样度,反映各群体在多个位点上的遗传变异,被认为是度量群体遗传变异的一个最适参数。就相同的分子标记而言,群体平均杂合度的高低反映了群体的遗传一致性程度,群体杂合度越低,表明该群体的遗传一致性越高,而群体的遗传变异越少,群体遗传多样性越低。本研究表明,甘南藏羊的平均杂合度为0.896,大于0.5,说明甘南藏羊具有较高的群体杂合度,群体内的遗传变异较大,群体近交程度弱,具有丰富的遗传多样性。遗传距离主要反映品种间亲缘关系的远近,因此,精确估测品种间的遗传距离,对于精确确立品种间的遗传关系显得非常重要。Takezaki等运用适于传统标记形式的有限等位基因模式(LAM)和适于微卫星标记的同步突变模型(SMM)的研究表明,Nei氏标准遗传距离比其他的距离适用性更广,在分析亲缘关系较近群体的进