15第十五讲蛋白质组学(二)剖析

第十五讲蛋白质组学〔二〕第一节概述其次节蛋白质组学争论技术一、二维凝胶电泳技术二、质谱技术三、酵母双杂交体系四、蛋白质芯片技术第三节蛋白质组学的应用和进展趋势其次节蛋白质组学争论技术二、质谱技术1、概述：质谱技术依据离子的核质比〔m/z〕对离子进展分别并鉴定的方法。质谱技术诞生于20世纪初，始终应用于有机小分子领域．直到20世纪80年月才渐渐进入到生物大分子领域。质谱技术在蛋白质组争论中的作用在蛋白质组学争论中，蛋白质鉴定是最关键的一环。质谱技术是蛋白质鉴定的主流技术，蛋白质组争论的主要支撑技术。对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于确定蛋白质或多肽的分子质量。通过分子量对蛋白质进展鉴定或性质争论。2、质谱仪的工作原理根本原理分子被离子化，离子化的分子，经过磁场或电场彼此分别，依据不同离子质荷比(m/z)的差异，对离子进展分别并确定分子质量。质谱仪组成：进样装置、离子化源、质量分析器、 离子检测器和数据分析等离子化源和质量分析器是两个核心部件质谱仪分类：依据两个中心部件可以分为电啧雾(ESI)快原子轰击质谱(FAB)飞机时间质谱四极杆质谱工作原理不同离子源和质量分析器相匹配——根本确定了质谱仪的工作原理和方式。如：ESI离子源与四极杆、离子阱质量分析器相匹配如：基质帮助的激光解析离子化源与飞行时间分析器相结合，〔MALDI-TOF-MS〕。质量分析器离子化源2、常用生物质谱的类型和特点〔1〕电喷雾质谱仪〔ESI-MS〕电喷雾离子化(elcctrosprayionizationESI)：一种“软电离”方式将样品溶解，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷口高电压作用下形成带电荷的微滴，微滴溶剂蒸发，微滴外表的电荷密度随半径减小而增加，到达某一临界点时，样品将以离子方式从液滴外表蒸发，进入气相，实现样品的离子化。ESI过程图解〔引自理查德J.辛普森.蛋白质与蛋白质组学试验指南,2023〕ESI离子化过程特点：ESI-MS是一种典型的“软离子”方式 没有直接的外界能量作用于分子，分子构造破坏较少。可以监测大分子质量的分子电喷雾质谱可形成多电荷离子，在较小的m/z范围内可以监测到大分子质量的分子。测定分子质量范围可测定分子质量10,0100Da以下的蛋白最高达15,01OODa马心肌红蛋白(分子质量16951.5Da)的假想ESI质量图谱〔引自理查德J.辛普森.蛋白质与蛋白质组学试验指南,2023〕带不同电荷蛋白质的〔抱负〕质谱图。常见的以电喷雾为离子化方式的质谱仪：电喷雾-三级四极杆质谱(ESI-Q-MS)电喷雾-三级四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)电喷雾-傅里叶盘旋共振质谱(ESI-FTUCR-MS)液相色谱-电喷雾质谱(LC-MS)液质联用(LC-MS)：电喷雾质谱承受液相方式进样，可与液相色谱联用。蛋白质或多肽经HPLC分别，直接进入质谱仪进展分子质量测定。T11：lycopeneLC-ESI-MS测定类胡萝卜素四级杆分析器构造四级场〔见以以以下图〕原理：在确定的Vdc和Vrf下，只有确定质量的离子通过四级场，到达检测器在确定Vdc和Vrf下，转变Vrf可实现扫描特点：扫描速度快，灵敏度高四根棒状电极，形成四级场1、3棒+(Vdc+Vrf)2、4棒–(Vdc+Vrf)时间飞行质谱分析〔TimeofFlightAnalyze〕特点仪器构造简洁，不需要磁场、电场等；扫描速度快，可在10-5s内观看到整段图谱；无聚焦狭缝，灵敏度很高；可用于大分子的分析〔几十万原子量单位〕，在生命科学中用途很广；(2)基质帮助激光解吸离子化质谱MALDI〔matrix-assistedlaserdesorptionionization〕将样品包埋在固体基质中，基质吸取激光供给的能量而蒸发，携带局部样品分子进入气相，将一局部能量传递给样品分子使其离子化。激光解吸基质的重要性早期—激光解吸离子化没有基质帮助，激光能量直接作用于被分析物，使分子碎裂，产生大量碎片，而不易得到分子离子。1988年，Tanaka等承受可吸取激光的基质〔如甘油〕包埋被分析物，避开激光对分子构造的破坏，测定蛋白分子质量为35kDa进一步承受固体基质使样品分散得更均匀，离子化效果更好。通常承受的激光束波长为337nm，样品的电离过程是由基质介导的，基质对分析的灵敏度、区分率和准确度有很大影响。常用的基质有〔对于蛋白质和多肽样品〕芥子酸(SA)、d-氰基-4羟肉桂酸〔CHCA〕、2,5-二羟基苯甲酸〔DHB〕等。MALDI主要特点离子电荷数通常为1～2，不形成简洁的多电荷图，对图谱解析比较清晰、简洁。如：乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图。固相进样方式，不受溶液性质的影响，对杂质的忍耐性较好。生物样品制备时在样品中引入去垢剂效果更好。(如尿素和SDS)等乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图常见质谱仪：基质帮助激光解吸离子化-飞行时间质谱MALDI-TOF-MSMALDI-TOF/TOF—MS基质帮助激光解吸离子化三级四极—飞行时间质谱MALDI-Q-TOF-MS3、肽质量指纹图谱与蛋白质鉴定技术肽质量指纹图谱(peptidemassfingerprinting，PMF)蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。每种蛋白质的氨基酸序列〔一级构造〕都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列各不一样，肽混合物质量数亦具其特征性，经质谱分析得到是图谱称为指纹图谱，应用：蛋白质鉴定在蛋白质数据库中，查找具有相像肽指纹图谱的蛋白质。酶切蛋白质，质谱分析得到PMF，检索数据库进展鉴定。PMF鉴定蛋白质根本路线蛋白质的肽谱的特点肽谱测定仪器：最有效的质谱仪：MALDI-TOF-MS灵敏度高，谱峰简洁，每个谱峰代表一种肽段。肽谱鉴定特点：假设蛋白质翻译后修饰，或电泳过程中某些氨基酸被修饰〔如半胱氨酸烷基化、甲硫氨酸氧化〕，蛋白质PMF就会有一些质量数与理论值不符，PMF鉴定的不需要将全部肽质量数都与理论值相符。PMF方法可同时处理很多样品，是大规模鉴定的首选方法。举例：PMF鉴定双向电泳分别蛋白质的实例，如以以以下图〔Next〕：来源于人白血病细胞的蛋白质，胰蛋白酶酶切，得到PMF，经数据库检索鉴定为人丙酮酸激酶。图中标有“*”峰：能与数据库中肽质量数理论值相符的。蛋白质的PMF2D凝胶上蛋白点的PMF丙酮酸激酶“*”与数据库相符人白血病细胞4、串联质谱技术概念：指用质谱作质量分别的质谱分析方法。也称质谱-质谱法，多级质谱法，二维质谱法和序贯质谱法。如：磁分析器-静电分析器-磁分析器的串联特点：自动化程度、敏感性，高通量分析如：二维色谱—串联质谱(2D-HPLC/MS)优点：可大规模分别鉴定蛋白质，在鉴定膜蛋白、低丰度的蛋白质及大分子蛋白质等方面显示出独特的优势，缺点：串联质谱技术得到的肽序列图谱相对简洁，从图谱进展完整的序列分析难度较大。如：肽序列标签技术(peptidesequencetag，PST)肽序列标签就是指分子量小，不影响介导蛋白活性的序列的多肽标签。氨基酸序列亲和标签+离子质量〔2H〕+蛋白质结合部位三者构成PSTPST和蛋白质结合，酶切，亲和分别，质谱分析，数据库检索鉴定蛋白质的方法。解决了肽谱分析的难题，灵敏度提高。三、酵母双杂交技术1、概念：依据生物体转录激活过程，在酵母细胞内建立的争论蛋白质与蛋白质之间相互作用的有效体系和方法。1989年，Fields等正式建立了酵母双杂交(veasttwo-hybrid)体系，又称为“相互作用陷阱”。2、酵母双杂交的原理：依据生物体转录激活过程建立的，先理解转录激活因子的激活过程转录激活因子的构造特点真核生物的位点特异性转录激活因子具有两个独立的构造域两个独立的构造域，各具功能，互不影响DNA结合构造域(DNAbindingdomain，BD)转录激活构造域(transcriptionalactivationdomain，AD)激活因子必需同时含有这两个构造域，否则无激活功能激活因子对基因表达的激活不同来源激活因子的BD区和AD区结合后AD和BD两种构造域的上游活化序列相互接近特异性地激活BD结合的基因，激活转录过程，基因表达依据这一原理，建立了酵母双杂交体系转录激活因子的构造和转录的激活2、酵母双杂交的原理：争论“X蛋白”和“Y蛋白”是否发生相互作用？将蛋白质X的基因与特异的BD基因融合，成为“诱饵”蛋白蛋白质Y基因与特异的AD基因融合为“猎物”蛋白编码两种构造域的基因在细胞核内同时表达时假设蛋白质X和Y之间存在相互作用，报道基因表达。假设蛋白质X和Y之间不存在相互作用，报道基因不表达。酵母双杂交系统原理示意图3、酵母双杂交系统的组成和特点〔1〕三个局部组成BD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称诱饵蛋白AD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称靶蛋白有一个或多个报告基因的宿主菌株常见报道基因E.coliLacZ基因，蓝白菌落筛选养分缺陷型筛选发光蛋白的基因〔GFP〕操作程序：克隆诱饵蛋白基因克隆靶蛋白基因构建BD融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称诱饵蛋白构建AD融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称靶蛋白载体导入含有一个或多个报告基因的宿主细胞细胞培育，观看报告基因的表达状况判定诱饵蛋白与靶蛋白的作用状况〔2〕为何构建酵母双杂交系统酵母细胞便于转化，结果易于筛选；选择性好。内源性酵母蛋白质极少与哺乳细胞靶蛋白结合，避开了对文库编码蛋白质的干扰。〔3〕酵母双杂交系统的进展反向双杂交体系：用于鉴定影响蛋白质间相互作用的化合物，在药物争论开发方面具有特殊重要的应用价值。三杂交体系：对双杂交体系的一个有益补充，用于争论多种蛋白质之间的相互作用。〔4〕双杂交系统的优势？融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞内进展。蛋白质能保持自然的折叠状态，类似人体的生理状态。证明蛋白质间的相互作用更接近于体内的真实水平。正是其他体外生化检验方法所缺乏的。筛选cDNA文库中编码的，与蛋白质特异作用的，成分。提示很多蛋白质之间的未知作用。有助于觉察〔很多〕新基因。双杂交系统检测到的相互作用在体内发生，不需要纯化蛋白。能检测到短暂的相互作用，广泛应用于信号通路的争论。〔5〕酵母双杂交系统的局限性只争论在核内表达的蛋白质的相互作用融合蛋白的构建可能影响蛋白质本身的活性或折叠状态；假设特定的翻译后修饰在酵母细胞中不发生，则不能检测到修饰后蛋白质的相互作用；很多蛋白质与BD融合，具有自激活效应，导致假阳性结果。四、蛋白质芯片技术1、概念蛋白质芯片〔proteinchip〕：又叫蛋白质微阵列〔proteinmicroarray〕是检测蛋白质之间相互作用的生物芯片。将大量纯化的蛋白质有规章的固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质，酶与底物，蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。蛋白质芯片技术依据蛋白质之间的相互作用的原理，利用蛋白质芯片，对样品中存在的特定蛋白质分子进展高通量分析检测的方法。是在蛋白质水平上，了解和争论，各种生命现象本质的重要方法。蛋白质芯片检测示意图2、根本原理将各种蛋白质〔探针〕有序地固定于载体上，制备蛋白芯片。常用载体：滴定板、滤膜或载玻片。利用蛋白与分子之间相互作用的原理，用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分〔报告分子〕与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去。利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度。通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作用的关系，测定各种蛋白质功能。4、分类：依据用途的不同，可分为蛋白功能芯片：〔用于争论〕将自然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片用于自然蛋白质活性及分子亲和性的高通量分析可用来进展蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-小分子、蛋白-DNA-RNA结合以及蛋白-酶反响等争论。蛋白检测芯片：〔用于检验〕将具有高度亲和性的蛋白质或多肽〔如单抗，小片段抗体，受体等〕固定在载体上，制备检测芯片。用以识别简洁生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。5、操作关键环节蛋白质芯片的制备报告分子〔探针〕的标记信号的检测及数据处理——仪器和软件蛋白质芯片的制备固相载体的选择和处理〔膜载体和玻璃载体〕；蛋白质靶标的处理；将蛋白质靶标点在固相载体上，并将其固定；蛋白质芯片的封闭。报告分子〔探针〕的标记荧光染料酶融合表达红色荧光蛋白〔RFP〕和绿色荧光蛋白〔GFP〕与检测蛋白形成融合蛋白共表达信号的检测及数据处理荧光标记的芯片：激光共聚焦或电荷耦合器件〔CCD〕检测酶标芯片：显色后用高精度的CCD检测应用计算机软件对检测结果进展数据分析，得出结论。6、蛋白质芯片的特点高通量、高灵敏度、操作自动化、重复性好大量蛋白质的快速、定性、定量〔？〕分析使用简洁，结果正确率较高只需少量标本承受光敏染料标记，灵敏度高，准确性好所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，有用性强其缺乏在于：稳定性，操作简洁7、蛋白质芯片的应用根底争论蛋白质－DNA相互作用争论蛋白质－mRNA相互作用争论临床：疾病诊断与疗效判定 需要的时间短、样品量少， 给出大量的诊断和预后信息。新药筛选与研制 查找药物的靶标，检查药物的毒副作用， 高通量筛选，缩短药物筛选时间环境监测及食品检测诊断举例：国内临床上应用较多的蛋白质芯片〔C-12〕多种肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统主要是检测患者血清中的肿瘤标志物含量及变化状况，作为推断常见肿瘤的发生、进展、治疗效果及其预后的监测指标。C-12多种肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统原理及操作步骤原理操作分析靶分子识别分子报告分子第三节蛋白质组学的应用和进展趋势概述已应用到生命科学各个领域如：细胞生物学、神经生物学、临床蛋白质组学、药理蛋白质组学、毒理蛋白质组学等。争论对象掩盖生物范围：原核微生物、真核微生物、植物和动物等涉及各种重要的生物学现象：如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。在临床上心脑血管病、肿瘤的发生〔机制〕与进展。毒理学、细胞分化与胚胎发育等基因调控机制。重大疾病的发生与治疗、个体化诊断、肝脏疾病、早老性痴呆药学争论。环境与安康关系方面的争论等。全面分析地方病发病机理了解一、蛋白质组学与微生物总体概述：为适应基因组学和蛋白质组学的进展，微生物蛋白质组学应运而生。微生物蛋白质组学争论集中在两个方面：各类模式微生物，特殊是典型的模式微生物〔大肠杆菌和酵母菌〕蛋白质组学的争论，几乎涉及了蛋白质组学现有领域的方方面面。 尤其是物质代谢、能量代谢和信号途径分析等病原微生物方面：蛋白质组学争论，对于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制备特殊重要。主要集中在以下几个层面：病原微生物，特殊是模式微生物在不同生长条件下的蛋白表达谱的争论；同一种病原微生物的不同菌株之间的蛋白质组的比较；同一种病原微生物的不同生理状态的蛋白质组学争论；病原微生物的“亚蛋白质组”分析；宿主和微生物的相互关系，查找新型疫苗的靶分子等。二、蛋白质组学与医学疾病与蛋白质的关系疾病的发生、进展及预后和正常生理过程，都与蛋白质的变化有关。对机体蛋白质的性质和数量变化的准确把握，是提示机体生理变化，疾病的病因、发病机制的重要手段。蛋白质组学技术在疾病诊断和治疗中的应用对于疾病生物标志物的检测具有不行替代的优势.〔高通量〕查找特异性蛋白质，用于疾病早期诊断。在消逝临床病症之前就实行相应的干预治疗手段。〔早期诊断、早期治疗〕在肿瘤上的应用从正常组织演化到早期、中晚期癌的不同的病程阶段蛋白质组的转变，争论肿瘤发生气制、标志物筛选和鉴定、肿瘤分类、治疗效果的评价，使肿瘤的诊断、分类和疗效评价，由单一肿瘤标志物进展成为蛋白质谱或基因谱的转变来进展综合推断。〔更客观准确〕结肠癌标记物觉察和应用正常结肠和结肠癌组织的比较蛋白质组学争论觉察三种特异性结肠癌标记物：(S100A8)、(S100A9)和(S100All)用于结肠癌的早期筛查乳腺癌标记物觉察和应用组学争论觉察：核基质蛋白66(NMP66)，28.3kDa，用于大规模的乳腺癌早期诊断临床试验。与现有血清学标记物CA15-3和CA27-29的特异性和敏感性相比，更高。在心血管疾病的应用扩张性心肌病的治疗是医学工作者面临的巨大挑战， 病理机制——不清晰通过蛋白质组分析有可能从蛋白质水平阐述其病理机制。争论结果觉察扩张性心肌病约100种蛋白质表达水平下调这些蛋白质变化可能在发病机制中起着关键作用有待于深入在感染性疾病上的应用很多致病微生物〔如支原体、结核分枝杆菌〕全基因组测序工作已经完成。蛋白质组分析有助于鉴定该微生物产生的全部蛋白质查找新的诊断标记、药物作用靶点和制备疫苗的抗原预备族等有望解决临床上令人麻烦的致病微生物耐药性问题研制出针对性的疫苗可进一步提高感染性疾病的预防治疗效果如：结核分枝杆菌的蛋白质组争论Rosenkrands等 筛选出一种新的蛋白质，用作诊断标记物，取得了满足的效果。三、蛋白质组学与药学疾病的发生和药物治疗靶点与很多蛋白有关蛋白质组学在查找有效的药物靶点及新药开发方面有广泛的应用。比较正常状态和疾病状态及药物治疗后细胞内蛋白质表达的差异高通量药物筛选，有可能找到有效的药物靶点的药物。蛋白质组学在药物作用方面的应用加速了药物开发、鉴定及改进过程例如，分析降血脂药物〔洛伐他汀〕的蛋白质表达差异——分析药理作用机制 说明洛伐他汀影响了与胆固醇代谢相关的一些蛋白质的表达。在药物毒理学争论中的作用如：环孢素A，对小鼠肾脏的毒性作用机制，的争论Steiner等通过二维凝胶电泳比较环孢素A，处理肾脏细胞〔前——后〕，蛋白质表达丰度变化，结果觉察：一个28kDa的特异蛋白(calbindinD)表达削减，现已证明环孢素A的毒性与这种参与钙离子结合及转运的蛋白质削减有关。靶点——新药四、蛋白质组学争论中存在的问题及前景展望1、蛋白质组学争论中存在的问题在方法学上二维凝胶电泳和质谱分析是主流技术，但其区分率、特异性、灵敏度及重复性有待进一步提高。〔如：E.Coli，1100个蛋白点，微量蛋白？〕如：细胞内执行重要功能的蛋白质和细胞因子表达丰度往往很低，用目前的显色方法难以区分。如：对一些高分子量、极酸或极碱性的蛋白质和膜蛋白分别难度较大。现有染色方法：考马斯亮蓝染色：操作简洁、显色背景低，但显色所需时间较长、灵敏度太低．低丰度蛋白难以显示；银染：费用相对低廉且灵敏度较高，但不适于胶内酶切及质谱分析，有待进一步的完善；荧光染色：灵敏度高、简洁与下游的质谱鉴定连接，线性动态范围超过了考马斯亮和银染，但费用昂贵，在确定程度上限制了它的应用范围。二维色谱技术更有利于高通量和自动化分析鉴定蛋白质。串联电喷雾质谱，进展蛋白质鉴定，但区分率和重复性有待提高。同位素标记亲和标签(ICAT)技术准确分析不同样品中蛋白质表达量差异的技术〔22H+42H〕简化了样品分析的简洁性，是蛋白质定量分别与鉴定的新工具。样品总蛋白质与不同标记的lCAT充分反响，进展蛋白酶切，经亲和色谱分别，再通过HPLC-MS/MS比较分析标记了同位素试剂肽段的质谱信号强度，进展不同条件下蛋白质差异表达的定量分析，该方法的缺点是只能鉴定含有半胱氨酸的蛋白质。酵母双杂交技术不能准确、高效分析简洁蛋白质连锁群间的作用关系获得的结果仅是“可能”的相互作用，还需进一步验证蛋白质芯片用于蛋白质识别的分子仍是亟待解决的问题2、蛋白质组学争论的前景——前途是光明的，任重道远在将来的生命科学领域乃至整个自然科学进展中地位举足轻重的在生命活动规律的提示和疾病治疗的探究方面具有宽阔的前景。21世纪将是一个整体细胞生物学的时代，蛋白质组学争论将成为后基因组学争论的重要内容。核酸水平的争论与蛋白质组信息相结合，才能准确地诠释生命科学的内涵。在提示诸如发育、新陈代谢调控、年轻等生命活动规律上将有所突破，最终将为人类重大疾病机制阐述、诊断和防治掀开新的一页。基于蛋白质组学的重要性，各国政府、生物医药跨国公司，纷纷参与到蛋