一测多评法测定复方丹参片中丹参酮类成分

一测多评法测定复方丹参片中丹参酮类成分

采用“一测多评价法”（quantima）将样品的典型组分（对照材料）作为内标，建立组分和其他组分之间的相对校正因子（rcf），并通过相对校正因子计算其他组分的含量。一测多评法适用于对照品难得或制备成本高或不稳定的情况下同类多成分的同时测定。目前一测多评法已被《中国药典》2010年版一部收录,用于黄连的含量测定。复方丹参片由丹参、三七、冰片3味中药组成,其中丹参为主要成分。丹参的活性成分按化学结构分为两大类:脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹参酚酸类,而丹参酮类化合物中,二氢丹参酮Ⅰ(dihydrotanshinoneⅠ)、隐丹参酮(cryptotanshinone)、丹参酮Ⅰ(tanshinoneⅠ)和丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA)的含量较高[3,4,5,6,7,8,9,10,11],但对光和热不稳定。《中国药典》2010年版一部复方丹参片项下丹参酮类的含量测定方法仅以丹参酮ⅡA作为单一检测指标,不能全面反映复方丹参片的质量。为提高复方丹参片的质量标准,以更好地控制复方丹参片的质量,同时基于丹参酮类化合物的不稳定性,本实验以相对较稳定且标准品易得的丹参酮ⅡA为内标,采用一测多评法建立复方丹参片中主要活性成分二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量测定方法,并将一测多评法与常规外标法进行比较,分析一测多评法用于复方丹参片中丹参酮类成分含量测定的可行性。1药品与试剂法Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters公司),DionexUltiMate3000高效液相色谱仪,DionexP680高效液相色谱仪(美国戴安公司)。色谱柱:EcosilC18(4.6mm×250mm,5μm),MerckPurospherSTARRP-18e(4.6mm×250mm,5μm),AgilentTC-C18(4.6mm×250mm,5μm),InertsilODS-3(4.6mm×250mm,5μm),WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm),WatersSunFireC18(4.6mm×250mm,5μm)。对照品二氢丹参酮Ⅰ(dihydrotanshinoneⅠ)、隐丹参酮(cryptotanshinone)、丹参酮Ⅰ(tanshinoneⅠ)和丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA)(中国食品药品检定研究院,纯度大于98%);甲醇为色谱纯,水为蒸馏水,其他试剂均为分析纯。复方丹参片(广州白云山和记黄埔中药有限公司,20批)。2方法和结果2.1流动相、检测波长色谱柱为EcosilC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相为甲醇-水(73∶27);检测波长为248nm;柱温25℃;流速1.0mL·min-1;进样量10μL。结果见图1。2.2对照品溶液的制备取二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1mL各含10.0、50.0、50.5、50.5μg的溶液,即得,低温避光保存。2.3超声减失剂制备取本品10片,除去薄膜衣,精密称定,研细,取约1g,精密称定,置具塞棕色瓶中,精密加入甲醇25mL,密塞,称定重量,超声处理(功率250W,频率33kHz)15min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,置棕色瓶中,即得。2.4阴性对照溶液的制备按照处方比例称取除去丹参的其他药材适量,按照复方丹参片的制法和供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液,即得。色谱图显示阴性样品在各指标成分相应的保留时间处无干扰,见图1。2.5hplc法取对照品溶液,分别进样1、5、10、15、20、25μL,按“2.1”进行HPLC分析。以对照品浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,得到各指标成分的线性回归方程和线性范围。逐步稀释对照品溶液,按信噪比3和10分别计算各指标成分的检测限LOD和LOQ。结果见表1。2.6重复性和稳定性试验日内精密度:每3h1次,以对照品溶液连续进样5次,计算得二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为1.14%、0.52%、0.48%、0.31%,符合要求。日间精密度:每天3次,以对照品溶液连续进样3d,计算得二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为1.23%、0.31%、0.28%、0.65%,符合要求。重复性:取同一样品6份,每份称取约1g,按“2.3”平行制备供试品溶液,进样测定,二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量的RSD分别为0.81%、0.55%、0.18%、0.51%,显示该法重复性良好。稳定性:取“重复性”下同一供试品,0、3、6、9、12、24、48h连续进样7次,记录48h内峰面积,计算得二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为0.54%、0.36%、0.64%、0.32%,显示稳定性良好。二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA在室温或低温、避光的条件下在对照品溶液中至少5d内保持稳定,在样品溶液中至少48h内保持稳定。2.7供试品溶液的制备取已知含量的同一批次样品0.5g,精密称定,精密加入高、中、低3个剂量的二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品,共9份,分别制备供试品溶液,按“2.1”进行分析。结果显示,二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的平均加样回收率分别为99.1%、103.5%、103.9%、103.4%,RSD分别为2.5%、1.0%、0.9%、1.8%,符合要求。2.81个研究周期和几个评价方法的重建2.8.1as/ak法测定各组分k、k的rcf取“2.2”制备的对照品溶液,除以下条件不同外,其余按“2.1”确定的色谱条件操作:分别进样1、5、10l、15、20、25μL测定,考察RCF在不同色谱柱和不同仪器上的重现性。按公式1计算内标丹参酮ⅡA与二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ之间的RCF:ue55fs/k为内标丹参酮ⅡA与组分k之间的RCF,As为内标丹参酮ⅡA的峰面积,Ws为内标丹参酮ⅡA的质量(或浓度),Ak为组分k的峰面积,Wk为组分k的质量(或浓度)。内标丹参酮ⅡA的含量用外标法测定,其他组分的含量可根据公式2计算得到:Wk/为样品中组分k的含量(单位:μg·g-1),Ws/为用外标法测得的样品中内标丹参酮ⅡA的含量(单位:μg·g-1),As/和Ak/分别为样品中内标丹参酮ⅡA和组分k的峰面积,ue55fs/k为内标丹参酮ⅡA与组分k之间的RCF。考察了Waters2695、戴安U3000,戴安P6803种高效液相色谱系统和EcosilC18(4.6mm×250mm,5μm)、MerckPurospherSTARRP-18e(4.6mm×250mm,5μm)、AgilentTC-C18(4.6mm×250mm,5μm)、InertsilODS-3(4.6mm×250mm,5μm)4根不同厂牌的色谱柱,各指标成分在不同色谱柱和不同仪器上的相对校正因子见表2。2.8.2相对保留值或保留时间差的定性相对保留值(rk/s)和保留时间差(ΔtR(k/s))是“一测多评”技术常用的指标成分色谱峰的定性方法。相对保留值(rk/s)为某指标成分的保留时间(tR(k))与内标的保留时间(tR(s))的比值(rk/s=tR(k)/tR(s)),保留时间差(ΔtR(k/s))为某指标成分保留时间(tR(k))与内标保留时间(tR(s))的差值(ΔtR(k/s)=tR(k)=tR(s))。分别考察相对保留值或保留时间差两种参数在不同色谱柱和不同仪器上的重现性,选取RSD较小的一种参数作为色谱峰定性依据。RSD<5%时符合要求,RSD>5%时,通过相对保留值或保留时间差不能准确定位,可通过其他方式对指标成分色谱峰定性。隐丹参酮与丹参酮Ⅰ在不同色谱柱上的目标峰的相对位置有时会互换,在AgilentTC-C18、WatersSunFireC18上丹参酮Ⅰ先于隐丹参酮出峰,在EcosilC18、MerckPurospherSTARRP-18e、InertsilODS-3、WatersSymmetryC18上隐丹参酮先于丹参酮Ⅰ出峰。考虑到所建立的含量测定方法对不同仪器和色谱柱应具有普遍适用性,用相对保留值或保留时间差对指标成分定性不可行。复方丹参片由丹参、三七、冰片3味中药组成,主要活性成分为丹参酮类、丹参酚酸类和三七皂苷类,物质基础研究透彻。对各指标成分进行了紫外全波长扫描,结果显示,二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的最大紫外吸收波长(λmax)分别为244、268、248、274nm。对复方丹参片的甲醇提取液进行了详尽的HPLC分析,仔细核对了每一个色谱峰的最大紫外吸收波长,没有发现其他成分有相似吸收干扰测定,故可根据各指标成分的最大紫外吸收波长对各目标峰定性。2.8.3比较了1个测量值和传统外标法的结果一测多评法与常规外标法的测定结果见表3,两种方法结果无显著性差异,证明用一测多评法对复方丹参片中丹参酮类成分进行质量评价是可行的。3讨论3.1复方丹参片类化合物6-三乙三醇文献[3,4,5,6,7,8,9,10,11]显示,丹参药材中主要的丹参酮类成分为二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。对复方丹参片的甲醇提取液进行HPLC分析,显示上述化合物也是复方丹参片中主要的丹参酮类成分。二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA均为复方丹参片治疗冠心病心绞痛的活性成分,故选择这些化合物作为含量测定的检测指标。3.2检测波长的选择考虑到所建立的含量测定方法应具有普遍适用性,对EcosilC18(4.6mm×250mm,5μm)、MerckPurospherSTARRP-18e(4.6mm×250mm,5μm)、AgilentTC-C18(4.6mm×250mm,5μm)、InertsilODS-3(4.6mm×250mm,5μm)、WatersSymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm)、WatersSunFireC18(4.6mm×250mm,5μm)共6根不同色谱柱进行了详细考察,结果显示,EcosilC18、MerckPurospherSTARRP-18e对各指标成分的分离效果较好,较难分离的二氢丹参酮Ⅰ峰与相邻杂峰的分离度均大于1.5,隐丹参酮峰与丹参酮Ⅰ峰的分离度均大于2.5,各指标成分的理论板数均高于3000;AgilentTC-C18、InertsilODS-3对二氢丹参酮Ⅰ峰与相邻杂峰的分离度、对隐丹参酮峰与丹参酮Ⅰ峰的分离度均大于1.5,各指标成分的理论板数均高于3000;WatersSymmetryC18、WatersSunFireC18对二氢丹参酮Ⅰ与相邻杂峰的分离不理想。综合考虑,选择EcosilC18、MerckPurospherSTARRP-18e、AgilentTC-C18、InertsilODS-3作为样品分析柱。因杂峰对各目标峰的干扰较大,尤其是二氢丹参酮Ⅰ峰附近的杂峰较多,故对检测波长进行了考察和优化。经对比各指标成分和相关杂峰的紫外吸收光谱,结合反复进样分析,结果显示,以甲醇-水(73∶27)为流动相进行等度洗脱,在248nm处检测,杂峰对各目标峰的干扰相对最小,各目标峰均能达到基线分离,故选择248nm作为检测波长。因248nm并非丹参酮ⅡA的最大紫外吸收波长,故与《中国药典》2010年版一部复方丹参片项下丹参酮ⅡA的含量测定方法比较,丹参酮ⅡA的检测灵敏度有所降低。3.3提取方法及用量因丹参酮类化合物结构类似,在各种溶剂中的溶解性趋向一致,故选择与《中国药典》2010年版一部复方丹参片项下丹参酮ⅡA的含量测定方法一致的甲醇作为样品提取溶剂。对样品提取方式进行了考察,结果显示,超声15、30、45、60min及静置过夜的样品各指标成分二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的峰面积均基本一致,说明上述提取方式对4种成分的提取效率无区别。因丹参酮类成分的热不稳定性,故未考察热回流提取和索氏回流提取等热提取方式。考虑到操作的简便