响应面法优化谷胱甘肽提取工艺

响应面法优化谷胱甘肽提取工艺

谷冈甘醇是含有l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸的三醇化合物。它是由含有糊精的生物活性三醇化合物（gsh）和氧化（gssg）组成的。GSH是机体内的重要活性物质,它具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性,维持DNA的生物合成,细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。临床用于中毒性肝炎和感染性肝炎治疗、有机物及重金属的解毒、癌症辐射和化疗的保护。在食品、医药、保健品、化妆品工业中也有广泛的应用价值。国内外关于谷胱甘肽的制备方法主要有:生物提取法、发酵法、吸附层析柱法、化学合成法及酶法等,其中水提取法应用较广,具有一定的优势,其提取原料多为啤酒废酵母。目前应用响应面分析法优化啤酒废酵母提取还原型谷胱甘肽工艺的方法还未见报道。为此,我们以啤酒废酵母为原料,以谷胱甘肽提取得率为指标,并通过响应面分析法对对影响谷胱甘肽提取工艺的主要影响因素料水比、提取时间、温度和醋酸用量进行分析和优化,为谷胱甘肽的规模化生产提供参考数据。1材料和方法1.1材料和试剂新鲜啤酒酵母河南南街村集团南德啤酒厂。所用试剂均为分析纯。1.2设备和设备电子天平、电热恒温水浴锅、pH计、离心机、显微镜等。1.3方法1.3.1离心酒花lma按1:1(V/V)的比例将啤酒废酵母泥加入超纯水中洗涤,并经100目筛子过筛,然后以3000r/min离心10min,如此3次,以除去其中的酒花等杂质。称取一定量的酵母泥,按料水比1:4的比例加入超纯水,并添加3%~5%的醋酸,于40℃水浴搅拌5h,置冰箱中冷却至室温,用2mol/L盐酸调pH3.0,以3000r/min离心10min可得谷胱甘肽(GSH)抽提液。1.3.2测量1.3.2.1.祖母细胞破壁计数采用血球计数板法。1.3.2.gsh含量的测定取样品1ml加入3ml0.15mol/LNaOH溶液中,摇匀,此时溶液pH≥12,再加入φ=0.03甲醛1ml,摇匀,静置2min,立即取1ml加入到5ml现配的DTNB溶液中,摇匀,25℃水浴静置5min后,于412nm处测定的吸光度,将该吸光度乘以1.02,根据建立的标准曲线计算测定样品中GSH的含量。2提取率的影响根据周楠迪等对GSH的提取的研究,发现料水比、提取时间、提取温度等因素对GSH的提取率影响较大。同时考虑到还原型谷胱甘肽容易氧化的特点,若在提取中添加一定量的醋酸,形成酸性环境,可使提取的谷胱甘肽处于稳定的状态。因此,通过单因素试验对影响谷胱甘肽提取效果的主要因素:料水比、提取时间、温度和醋酸用量进行初步研究。2.1谷胱甘肽提取在谷胱甘肽提取中,料水比对酵母的自溶有直接的影响,也会对谷胱甘肽的提取形成影响。因此,取具有不同的料水比的酵母原料,调pH6.0(添加3%的醋酸),于40℃水浴搅拌5h,进行谷胱甘肽提取,其结果见图1。从图1可见,随着料水比的增加,谷胱甘肽提取率在不断的提高,但料水比达到1:4以后增加幅度不大。因此,在生产中综合节水和提取负荷考虑,选料水比为1:4较为合适。2.2谷胱甘肽得率测定取料水比为1:4的酵母原料,调pH6.0(添加3%的醋酸),在40℃水浴搅拌下进行自溶,随着自溶的进行,谷胱甘肽得率会随时间而发生变化,结果见图2。由图2可知,随着提取时间的延长,谷胱甘肽得率在5h左右达到最高,自溶的进行,因此,可初步确定谷胱甘肽提取时间为5h左右。2.3谷胱甘肽提取率测定温度不仅对酵母的生长代谢有着直接的影响,对谷胱甘肽的稳定性也有一定的影响,取料水比为1:4的酵母原料,调pH6.0(添加3%的醋酸),分别在20、30、40、50、60、70及80℃条件下,搅拌自溶5h,观察谷胱甘肽提取得率的变化,结果如图3。由图3可见,当温度超过40℃后谷胱甘肽(GSH)的含量急剧下降,可见温度对GSH的稳定性影响较大,因此,谷胱甘肽提取的最高温度应低于40℃。2.4谷胱甘肽得率测定酵母的自溶是在其体内酶的作用下进行的,而环境的pH值将直接影响其体内酶的活性。取料水比为1:4的酵母原料,添加不同量的醋酸,于40℃水浴搅拌自溶5h,观察其抽提液中谷胱甘肽得率的变化,结果见图4。从图4可知,当醋酸添加量在3.5%左右时间,GSH存在的环境pH为5.0~6.0,此时GSH得率最高。2.5改善中俄固甘醇提取工艺的条件2.5.1响应面法优化谷胱甘肽提取综合单因素试验结果,根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原则,选择对谷胱甘肽提取影响较大的三个因素:提取时间、提取温度和醋酸添加量,分别以X1、X2和X3代表,以谷胱甘肽提取得率为评判指标,采用三因素三水平的响应面分析方法,各因素及水平编码如表1所示。试验安排及结果见表2。2.5.2谷胱甘肽提取得率的显著性分析应用DesignExpert软件,对表2中的数据进行多元回归拟合,选择对响应值显著的各项,可得提取时间、提取温度和醋酸添加量与谷胱甘肽提取得率间的二次多项回归方程:对回归方程进行方差分析和显著性检验,结果见表3。由表3可知,该模型回归显著(p<0.0001),方程的一次项、二次项的影响都是显著的,且交互项X1X3、X2X3也显著,且该模型的R2=0.9914、R2Adj=0.9804,说明该模型与实验值拟合较好,可用于酵母谷胱甘肽抽提工艺的理论预测。2.5.3不同种类组合验证实验结果为了验证谷胱甘肽提取模型的有效性,在提取时间(h)、提取温度(℃)和醋酸添加量的试验水平范围内,选择3个组合进行验证实验,结果见表4。从表4可看出,模型预测值与实测值相吻合极好,可利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。2.5.4效果分析与评价由回归方程所作的响应曲面图及其等高线图,见图5、6。通过该组图即可对任何两因素交互影响谷胱甘肽提取得率的效应进行分析与评价。对回归方程求一阶偏导数,当响应值Y有最大值时可求得各因素的水平:X1=0.26、X2=0.36、X3=0.05,转换后可得谷胱甘肽的最佳提取条件:在料水比1:4、温度43.6℃的条件下,添加3.5%的醋酸,提取5.5h。此时谷胱甘肽的提取得率可达到29%以上。3响应面分析法优化谷胱甘肽提取的最佳工艺利用Box-Benhnken的中心组合实验设计和响应面分析法,借助Design-Expert软件能简便,可靠地对数据进行分析,得到谷胱甘肽提取的最佳工艺。实践证明采用响应面分析法对谷胱甘肽提取的最