分子生物学简答题

课后思考题1.试述乳糖操纵子的构造及调控原理？乳糖操纵子开放转录需要什么条件？（1）乳糖操纵子的构造：含Z、Y、A3个构造基因，分别编码乳糖代谢的3个酶；一种操纵序列O，一种启动序列P，一种CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区。乳糖操纵子的上游尚有一种调节基因I。（2）阻遏蛋白的负性调节：I基因的体现产物为一种阻遏蛋白，在没有乳糖存在时，阻遏蛋白与O序列结合，妨碍RNA聚合酶与P序列结合，克制转录启动，乳糖操作子处在阻遏状态；当有乳糖存在时，乳糖转变为半乳糖，后者结合阻遏蛋白，使构象变化，阻遏蛋白与O序列解离，在CAP蛋白协作下发生转录。（3）CAP的正性调节：分解代谢基因激活蛋白（CAP）分子内存在DNA和cAMP结合位点。当没有葡萄糖时，cAMP浓度较高，cAMP与CAP结合，cAMP-CAP结合于CAP结合位点，提高RNA转录活性；当有葡萄糖时，cAMP浓度减少，cAMP与CAP结合受阻，乳糖操纵子体现下降。（4）协调调节：乳糖操纵子阻遏蛋白的负性调节和CAP的正性调节机制协调合作，CAP不能激活被阻遏蛋白封闭基因的体现，但如果没有CAP存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解离仍无转录活性。因此，乳糖操纵子开放转录需要的条件是：1）诱导物乳糖存在，解除阻遏蛋白的负调节。2）葡萄糖缺少，CAP蛋白活化，启动正调节。2.试述原核生物和真核生物基因体现调控特点的异同。（1）相似点：转录起始是基因体现调控的核心环节。（2）不同点：1）原核生物基因体现调控重要涉及转录和翻译水平；真核基因体现调控涉及染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次。2）原核基因体现调控重要为负调节；真核生物基因体现调控重要为正调节。3）原核转录起始不需要转录因子，RNA聚合酶直接结合启动子，由σ因子决定基因体现的特异性；真核转录起始需要基础、特异两类转录因子，依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质互相作用，调控转录激活。4）原核基因体现调控重要采用操纵子模型，转录出多顺反子RNA，实现协调调节；真核基因转录产物为单顺反子RNA，功效有关蛋白质的协调体现机制更为复杂。4.简述真核生物基因体现调控的特点。（1）真核生物基因体现调控重要为正调节。（2）真核基因转录产物为单顺反子RNA，功效有关蛋白质的协调体现机制更为复杂。（3）真核生物基因体现调控含有典型的多级调控特点，涉及染色质水平调控、转录调控、转录后调控、翻译调控等。（4）与基本调控点即转录起始亲密有关的是染色质水平的调控和转录水平的调控。染色质水平的调控是真核基因转录起始调控的前提，染色质核小体中组蛋白的不同化学修饰组合可形成组蛋白密码，通过参加调节染色质重塑，变化染色质活性，DNA甲基化修饰普通克制基因的转录活性。（5）转录起始是真核生物基因体现调控的最重要环节。真核生物RNA聚合酶对启动子的亲和力极小，必须依赖一种或多个转录因子的作用才干起始转录。调控作用重要是通过反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成，影响RNA聚合酶的作用。顺式作用元件是调控转录起始的DNA序列，涉及启动子、增强子、沉默子等，反式作用因子是能与序列特异DNA结合的蛋白，即转录因子，重要功效是使基因开放和关闭，从而影响转录。（6）转录后调控涉及对mRNA的加工修饰、转运、细胞质定位以及稳定性等多方面的调控。翻译调控点重要在起始阶段和延长阶段，翻译起始因子的磷酸化可调节蛋白质翻译。另外，小分子RNA通过干扰翻译过程克制基因体现。真核基因体现调控特点：1）现有瞬时调控，又有发育调控2）调控环节更多3）染色质构造变化影响转录效率4）转录调控以正调控为主5）调控元件复杂并且能够远离转录区6）转录因子种类多，调控机制更复杂真核生物和原核生物基因构造的差别：1）原核生物的构造基因是持续的，RNA合成后不需要剪接加工；由外显子（编码序列)和内含子（非编码序列)两部分构成，编码序列不持续，称为断裂基因2）真核生物的基因都是单顺反子；原核生物大多是多顺反子真核生物、原核生物、病毒基因组特点差别：1）病毒：①所含核酸的种类与构造不同②所含核酸的分子数不同③基因组小④基因组为单倍体并且所含基由于单拷贝⑤基因组序列基本上都是编码序列⑥基因的持续性不同⑦有关基因串连成一种转录单位2）原核：①基因组DNA大多数为超螺旋构造的单一闭合双链分子②基因组DNA只有一种复制起点③基因组序列以编码序列为主④基因组所含基因的数目比病毒多3）真核：①染色体DNA是线性分子②染色体DNA形成染色体构造③基因组序列中仅有不到10%是蛋白质编码序列④基因在基因组中散在分布⑤基因组序列中包含大量重复序列⑥基因组中存在多个基因家族⑦基因组中含大量转座子3.什么是诱导和阻遏？以乳糖和色氨酸操纵子为例，比较两种操纵子的构造及负调控方式的差别。在特定环境信号刺激下，对应的基因被激活，基因体现产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中体现增强的过程，称为诱导。如果基因对环境信号应答是被克制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因体现产物水平减少的过程称为阻遏。乳糖和色氨酸操纵子相似之处：都是DNA序列，是转录的功效单位，由调节基因、启动子、操纵基因和构造基因构成。不同之处：乳糖操纵子是负控控诱导，色氨酸操纵子是负调控阻遏。乳糖操纵子是一种可诱导的操纵子。乳糖操纵子的调节基因编码阻遏蛋白，当无乳糖存在时，阻遏蛋白与操纵序列结合，制止RNA聚合酶对构造基因的转录。当乳糖存在时，乳糖的分解产物半乳糖作为诱导剂与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象变化，造成阻遏蛋白与操纵序列解离，诱导基因的转录。色氨酸操纵子重要受阻遏克制调控，在细胞内无色氨酸时，阻遏蛋白不与操纵序列结合，转录开放；当色氨酸浓度较高时，色氨酸与阻遏蛋白形成复合物并结合到操纵序列上，关闭基因体现。5.简述胰高血糖素升血糖的信号转导途径（以PKA信号通路为例）。胰高血糖素升高血糖是由G蛋白偶联受体介导的。G蛋白偶联受体由一条多肽链构成，其肽链重复跨膜七次，膜内部分与G蛋白偶联。G蛋白是GTP结合蛋白，结合GTP时为活化形式，作用于下游分子，并开放对应信号途径；同时含有GTP酶活性，水解GTP为GDP时为非活化形式，使信号转导关闭。胰高血糖素和受体结合后激活G蛋白，使之构象发生变化。α亚基与GDP的亲和力下降，结合的GDP被GTP取代，结合了GTP的α亚基与βγ亚基解离，进入活化状态。活化的α亚基作用于下游的效应分子，这种活化状态将始终持续到GTP被α亚基本身水解为GDP，又再次与βγ亚基形成复合体，回到静止状态。活化的α亚基将信号传递给腺苷酸环化酶AC，使AC活化，催化ATP生成小分子信使cAMP，cAMP又激活蛋白激酶A（PKA），PKA激活糖原磷酸化酶b激酶，增进糖原分解代谢；同时克制糖原合酶，克制糖原合成，从而使血糖升高。6.列举G蛋白偶联受体介导的细胞信号转导通路。（1）cAMP-PKA通路。激素和受体结合后激活G蛋白，释放GTP结合形式的活化的α亚基，α亚基激活腺苷酸环化酶（AC）。AC催化产生小分子信使cAMP。cAMP结合PKA，通过变构调节作用激活PKA，PKA通过磷酸化作用激活或克制多个效应蛋白，产生多个细胞效应。（2）IP3/DAG-PKC通路。这类信号转导通路中的细胞外信号分子结合受体激活G蛋白，释放活化的α亚基，α亚基激活PLC。PLC水解膜组分PIP2，生成DAG和IP3。IP3从膜上扩散到细胞质中，与内质网和肌浆网上的受体结合，增进这些钙储存库内的Ca2+快速释放，使细胞质内的Ca2+浓度升高。Ca2+与细胞质内的PKC结合并聚集至质膜。DAG生成后仍留在质膜上，当结合有Ca2+的PKC聚集到质膜时，DAG、磷酯酰丝氨酸与Ca2+共同作用于PKC的调节构造域，使PKC变构而暴露出活性中心。PKC通过磷酸化作用激活多个功效蛋白质，调节物质代谢、基因体现等生理活动。（3）Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶通路。细胞质内Ca2+浓度升高后，Ca2+可与细胞质内的钙调节蛋白结合，形成含有调节功效的Ca2+/CaM复合物。Ca2+/CaM复合物的下游信号分子为钙调蛋白依赖性蛋白激酶。钙调蛋白依赖性激酶属于蛋白质丝/苏氨酸激酶，如肌球蛋白轻链激酶、磷酸化酶激酶、钙调蛋白依赖性激酶。这些激酶可激活多个效应蛋白质，在收缩和运动、物质代谢、神经递质的合成、细胞分泌和分裂等多个生理过程中发挥重要作用。7.简述G蛋白偶联受体介导的信号转导的基本模式。（1）细胞外信号分子结合受体，通过别构效应将其激活。（2）受体激活G蛋白，G蛋白在有活性和无活性状态之间持续转换，称为G蛋白循环。（3）活化的G蛋白激活下游效应分子。（4）G蛋白的效应分子向下游传递信号的重要方式是催化产生小分子信使。（5）小分子信使作用于对应的靶分子（重要是蛋白激酶），使之构象变化而激活。（6）蛋白激酶通过磷酸化作用激活某些与代谢有关的酶、与基因体现有关的转录因子以及某些与细胞运动有关的蛋白，从而产生多个细胞应答反映。8.列举第二信使分子的种类及其重要特点。第二信使分子的种类重要涉及环腺苷酸（cAMP）、环鸟甘酸（cGMP）、甘油二酯（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）、Ca2+、NO等。重要特点：（1）为细胞内含有信号转导功效的小分子化合物。（2）在完整细胞中，该分子的浓度或分布在外源信号的作用下发生快速变化。（3）该分子类似物可模拟外源信号的作用。（4）阻断该分子的变化可阻断细胞对外源信号的反映。（5）该分子在细胞内有拟定的靶分子。（6）可作为别位效应剂作用于靶分子。（7）在信号转导过程中的重要变化是浓度变化。PKA使丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化PKC属于丝/苏氨酸蛋白激酶上游信号：腺苷酸环化酶鸟苷酸环化酶常见第二信使：cAMPcGMPIP3←脂类→DAGCa2+效应蛋白：蛋白激酶APKGIP3门控钙通道PKCPKC,钙调蛋白激酶9.请比较PCR反映和体内DNA复制过程的异同点。10.克隆载体普通含有哪些基本特性？（1）含有自主复制起点，使载体在宿主细胞中进行自主复制，并能使克隆的外源DNA得到同时扩增；（2）最少有一种筛选标志；（3）有适宜的限制性核酸内切酶单一酶切位点，可供外源基因插入时选择。11.简述分子生物学实验中的α互补和蓝白斑筛选的原理。β-半乳糖苷酶（β-gal）的α片段与受体菌编码的ω片段（lacZ-ω）能够互补结合发挥β-gal的活性，称作α互补。某些质粒上带有β-半乳糖苷酶α片段的编码序列LacZ’，转化进入受体菌，可形成α互补，即可催化底物X-gal产生蓝色产物，使菌落变蓝。由于这些质粒的多克隆位点位于LacZ’内部，插入外源DNA片段后，使LacZ’不能编码产生有功效的β-gal的α片段，不能发生α互补，在X-gal存在下受体菌落呈白色。因此，蓝色菌落代表载体中LacZ’基因活性完好无损，没有插入外源DNA片段，白色菌落则表明着所含质粒带有外源DNA片段，为重组质粒。用蓝白斑筛选能够来分辨转化进入受体菌的是空载体还是重组质粒。12.试述重组DNA技术的基本环节。（1）分：目的DNA的分离获取；（2）选：载体的选择与构建；（3）接：目的DNA与载体连接；（4）转：重组DNA转入受体细胞；（5）筛：重组体的筛选与鉴定。13.以镰状细胞贫血病为例简述疾病发病分子机理，并介绍对其进行PCR-RFLP基因诊疗的办法。镰状细胞贫血是一种常染色体显性遗传血红蛋白(Hb)病，属于分子病。正常成人血红蛋白是由两条α链和两条β链互相结合成的四聚体，α链和β链分别由141和146个氨基酸次序连构造成。镰状细胞贫血患者因β珠蛋白基因（HBS）发生第6密码子的错义突变（A变为T），使编码生成的β链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所替代，形成了异常的血红蛋白S（hemoglobinS，HbS），取代了正常血红蛋白（HbA），在氧分压下降时HbS分子间互相作用，成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞（镰变）造成贫血症状。HBS突变碱基位于限制性核酸内切酶MstII位点（CC.TNAGG）中，突变（A变为T）造成该限制性酶切位点丢失，因此，能够设计镰状细胞贫血的PCR-RFLP诊疗办法：PCR扩增HBB基因含第5/6/7密码子的片段（1.35kb），用MstII充足消化扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳分析。正常人扩增产物显示1.15kb和0.20kb两条条带，镰状细胞贫血患者扩增产物则显示1.35kb单一条带，携带者则有1.35kb、1.15kb和0.20kb三条条带。14.简述基因治疗的几个方略和基本程序。基因治疗的方略涉及：（1）缺点基因精确的原位修复，涉及对致病基因的突变碱基进行纠正的基因矫正和用正常基因通过重组原位替代致病基因的基因置换。属于精确修复，是最抱负的治疗办法。（2）基因增补：不删除突变的致病基因，而在基因组中额外插入正常基因，在体内体现出功效正常的蛋白质，实现疾病的治疗。（3）基因沉默或失活：对于某些由于某些基因过分体现引发的疾病，向患者体内导入有克制基因体现作用的核酸，降解对应的mRNA或克制其翻译，实现疾病的治疗。基因治疗的基本程序：（1）选择治疗基因：根据疾病的治病基因，选择对应的正常基因或者通过改造的基因作为治疗基因。（2）选择基因载体：有病毒载体（临床上惯用）和非病毒载体。（3）选择靶细胞：普通是体细胞，惯用的如造血干细胞、皮肤成纤维细胞和肌细胞。（4）将治疗基因导入人体，分：间接体内疗法，将靶细胞从体内取出后进行基因导入，筛选出成功导入的细胞，繁殖扩大后再输回体内，使治疗基因在体内体现；直接体内疗法，是将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入对应细胞并体现。（5）治疗基因体现的检测：用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等办法检测导入的治疗基因与否被正取体现。15.谈谈你对基因异常和疾病发生之间关系的认识。（一）人类全部疾病均为视为基因病。（1）影响疾病发生发展的基因分为致病基因和疾病易感基因，统称为疾病有关基因。如果一种疾病的表型和一种基因型呈现直接对应的因果关系，该基因就属于致病基因，这类疾病重要是单基因病。复杂性疾病，如肿瘤、心血管疾病等，遗传因素体现为2个以上基因甚至多个基因间的互相作用，单一