基础生化实验

DNA聚合酶连锁反应DNA电泳分析DNA聚合酶连锁反应目的：聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction,PCR)能短时间增殖、放大特定的DNA片段，而使得原先可能才只有几个pg的DNA增加至mg，以利于其它实验的进行。原理：变性反应(denaturation),使DNA的两股分离。缓冷配对反应(annealing),使引子与目标DNA配对。延长反应(extension),合成新的DNA股。每一个循环操作可使DNA的量添加一倍，若重复操作多次，以数学公式计算，DNA增加的量将会是2n,n是代表重复操作的次数。在理想的聚合酵素链锁反应条件下，DNA是以几何级数增加。理论上，一个DNA分子若重复操作PCR25次，那么DNA的分子数将会扩增到33554432个分子。这个DNA的量已足够在Agarose凝胶电泳中观察到。试剂、器材、仪器：10xPCRbuffer成分：500mMKCl、100mMTris-HCl、pH8.8、15mMMgCl2、1%TritonX-10010|J1探TaqDN聚合酶需要有Mg2+(MgCl2)才能进行反应；但是Mg2+会和带负电的template、primer和dNTP结合，加强双股DNA的键结。所以Mg2+的浓度会影响PCR的效率和特异性，Mg2+过低PCR产物会减少，此外Mg2+解冻时会有沉淀产生。dNTP成分：dATP、dCTP、dGTD、dTTP各1.25mM16p1探dNTP会和Mg2+结合，所以过量dNTP会影响Mg2+浓度。※过多的dNTP也会增加Taq的错误率和抑制其活性。此外当某一种dNTP的浓度较其它三种低时也会增加错误率。Primers是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制(RNA引子)和聚合酶链锁反应(PCR)中人工合成的引子(通常为DNA引子)。TaqDNApolymerase从热泉中的嗜热性细菌仃hermusaquaticus)所分离出来的耐高温DNA合成酵素，每秒大约合成150个核甘酸。dH2O灭菌水。PCR管为了使加热均匀且快速，所以PCR专用管都是薄壁的。使用一般微量管取代，在时间控制上会有差异。常用的PCR管有0.2mL与0.5mL两种体积；0.2mL管各家厂商都只有作薄壁的，但0.5mL管有分一般与PCR用，使用前需注意。不过现在用0.5管的PCR仪越来越少了；新机种都是用0.2管，甚至0.1半量管或384孔盘。PCR仪器将PCR步骤自动化的仪器将试剂滴入PCR管混合均匀将PCR管制入PCR仪器设定反应条件，反应完毕即为所求DNA电泳分析目的：用电泳的方式来测量样品DNA的纯度及分子量大小，以利于其它实验的进行。原理：DNA电泳主要是利用：1.正负电场DNA本身带负电电泳胶内部形成各种大小不同的孔洞DNA是高度负电荷的聚分子，且负电荷是均匀分布于骨架的磷酸根上，因此不论长短，DNA的负电密度(即单位质量带有的负电荷数目)是相同的，因此在电场中感受的引力就相同(差异不大)。所以电泳DNA并不是依分子的电荷差异而分离，而是依分子大小、构形差异而分离。一般而言，片段小的DNA因为可以穿过较小的孔隙，所以泳动速度较快，而大片段DNA只能通过大孔洞，所以速度较慢；分子的形状也会影响电泳的速率，一般而言，速率大小为：超螺旋＞环型＞线型。此外，电泳DNA时，电压的强度、胶体的浓度、及缓冲剂的种类都会影响移动的快慢。试剂、器材、仪器：(1)电泳用染剂功能如问题二所述(2)1%agarosegelagarosege的介质孔隙较大‘polyacrylamide的孔隙较小。所以分离大分子DNA时，会依照有否连接载体、是否切割完全、样品中DNA大致的分子量等调配适当比例的agarose一般0.8%agaros适合区分0.5~10KbDNAo若DNAsize更大则须调降agaros的浓度比例(0.3%)若分离的DNA较小则需升高agaros的浓度(2%)。其实DNA的分离不尽然一定是agaros，e例如操作DNAsequencing时，为了更细微的比较，会使用olyacrylamide<gel(3)SybreGreen能嵌入DNA碱基中，经UV光照射能放出可见光TAE电泳缓冲溶液做为缓冲溶液DNAMARKER做为分子量的对照组电泳槽数字影像系统(8)微波炉步骤:将TAE与agarose依适当比例混合加热。将1之混合液倒入agaros制备槽并去除气泡、杂质。将agaroseg加入电泳槽，并加入TAE覆盖之。将DNA与loadingbuff混合，加入agaroseg孔洞。调整适当电压开始电泳。电泳完成后将agaroseg取出浸泡至SybreGree中30分钟。以数字影像系统观测，纪录之。问题一：DNA电泳后卫何出现2条蓝色，深蓝色与浅蓝分别由哪项化学物质所呈色？

答:深蓝：答:深蓝：bromophenolBlue（溴酚蓝）浅蓝：XylenecyanolFF（二甲苯蓝）问题二:DNASample加入6