中药作用机制及其靶点的研究进展

中药作用机制及其靶点的研究进展

中国拥有丰富的植物资源，中传统的中药对疾病的治疗有着悠久的历史。中药作为我们中华民族的文化瑰宝,在我国医药史上发挥了不可替代的作用。而随着时代的不断发展,人们逐渐意识到在传统中药基础上进行创新发展的必要性。由于大多数中药没有明确的分子靶点,作用机制尚不清楚,许多中药的研发无法遵循类似西药的从先导化合物发现、优化再到备选药物的主要研发历程。系统构效关系研究也几乎不可能进行,因此难以评价先导化合物对靶点的亲和性和选择性,从而无法保证让最有效的化学实体进入临床研究。诸如此类原因使得中药研发难以被国际医药主流学术界所接受,因此用科学的方法阐释中药物质基础及其作用靶点,实现中药现代化也成为了我国许多药物研究工作者的重要历史责任。计算机辅助药物设计(computer-aideddrugdesign,CADD)是通过计算机的模拟、运算来预测小分子与受体生物大分子之间的作用,包括分子对接、药效团识别、定量构效关系等技术。利用这些手段可以从分子水平上对中药复方中包含的小分子化合物进行研究,寻找并阐释方中有效成分与机体靶标受体的作用情况,从而最终确定具有药理活性的目标化合物。近年来,国内许多研究机构开始尝试利用这项技术寻找中药复方中的有效成分,并取得了相应的研究成果。1中药组同关键分析传统中药复方通常由多味药材组成,即所谓的“君臣佐使”。中药四气、五味以及升降浮沉、归经等作为其各种特性的描述,均是通过药物作用于人体产生疗效而总结出的理论。“酸入肝、辛入肺、苦入心、咸入肾、甘入脾”,可见药味与脏腑之间有着特殊的联系规律。一般来说,中药组分越多则作用于机体不同途径的靶点也就越多。而且,任意一味药材都包含许多化合物,如生物碱、黄酮、苷、醌、甾、萜、苯丙素等,因此要确证具体某个有效成分及其相应靶标成为当前药物研究工作者的难题,解决这些问题也必将对中药现代化、中医方剂配伍、中药质量控制、西药中药化等产生积极影响。2cdcd的应用领域CADD是随着分子生物学、计算机科学等相应学科发展而产生的一种新的药物研究手段,其应用领域包括全新药物设计、数据库筛选以及药物的构效研究。CADD不仅能减少盲目实验带来的资金浪费,做到有的放矢,而且更为高效,能缩短药物研发周期。作为一种有效的技术手段,在对中药作用靶点的预测以及推动中药现代化发展方面必将发挥重要作用。2.1构建生物分子数据库中药复方本身就是一个大的分子库,对于其中任意一味药材的化学成分通常能通过提取分离得到确认,因此将所有小分子进行收集整理并建立相应的分子数据库作为待研究的对象,将有助于寻找相应的生物大分子靶点。目前,国内外开始尝试各种中药活性成分的搜索工作,并开发出重要的中药化合物数据库,其中比较著名的有TCMDatabase@Taiwan以及中国天然产物数据库(CNPD)。2.2中药成分及功效靶点确证是西药开发研究的主要技术特点之一,现代药物研究同样也证实了中药所具性能的客观物质存在,每一味中药成分都并非单一一种,包含了几十乃至上百个化合物,即多成分共存的特质。这也正是中药作用多靶点、多途径,甚至是其副作用及毒性相对较小的根本所在。功能靶点是指中药直接作用的对象,从微观上来说药物与机体某个部位作用产生药效,其实质就是中药的小分子化合物与机体生物大分子受体(酶、核酸等)相互识别结合的过程。2.2.1靶标分子的选择对于药效作用较为明确、单一的中药复方,可以依据信息首先从蛋白质数据库中检索并搜寻出相关的靶标大分子,并且力求全面。找到这些虚拟靶标后,对其活性位点进行分析,然后以2.1中构建的中药复方小分子数据库与这些蛋白靶点依此进行对接,并对匹配结果进行打分,从而筛选出复方中潜在的活性成分,常用的软件包括Dock、FlexiDock(Sybyl)等。2.2.2cytscapee预测网络靶点这一概念的提出,促使药物研究的重点从“单一靶点、单一药物”向“多靶点、多药物”转变,这也是更具前景的新型药物研究模式。中药作为一个拥有多组分的小分子集合体,具备针对疾病多靶点进行协同作用的物质基础。因此通过“网络靶标”的筛选可以从分子层面寻找对于疾病产生作用的关键靶点,并发现针对这些靶点进行干预的活性化合物及相应的协同药物组合模式。Cytoscape是一个在生物信息学上开发并得到广泛应用的软件包,它在生物信息网络可视化以及数据整合研究方面十分有效。在中药“网络靶标”研究中,常包括药物-靶标网络(drug-targetnetwork,D-Tnetwork)以及药物-药物关联网络(drug-drugassociationnetwork,D-Dnetwork)两方面研究。在D-Tnetwork分析中,是以与疾病所有相关联的靶点与中药中所有的化学成分构建出药物-靶点相互作用的网络,Cytoscape可以将所有关联方式显示出来,并通过数据分析将关联度较高的一些靶点筛选出来,这些靶点即可认为是影响疾病的主要靶点。而通过D-Dnetwork分析,中药中的某个得分高的化合物表明与多个靶标进行作用,而不仅是单一靶标,因此也可认为是中药中的活性成分。2.2.3基于药分析的分子库构建中药复方包含的化合物种类繁多,作用靶点较为复杂。而中药之所以以其整体发挥药效,原因可能也在于各靶点药效之间相互配合,起到协同作用。因此,中药药效团模型也应区别于西药,呈现出多样化的特点。依据该性质,整个中药复方小分子库应根据药效团的不同分为若干个分子集合。首先,在药理学性质的基础上推测药物可能作用的靶标;然后寻找针对这些靶点现有的药物或者活性抑制剂,利用其晶体结构构建出相应的药效团模型;在基于药效特征元素基础上进行提问,通过药效团识别方法对2.1中构建的分子库进行筛选;最后,将得到的符合条件的化合物采取重新组方并进行活性测试,依据实验结果进一步对先期预测的靶点进行验证。3分子对接方法中药抗肿瘤现在逐渐成为人们研究的焦点,许多中药也被证实具有抗肿瘤功效,并通过多成分、多途径、多靶点抑制或杀灭肿瘤细胞。多项实验研究发现中药抗癌机理可能包括细胞毒作用、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、调节细胞信号传导、调节机体免疫功能、逆转癌细胞多药耐药作用等。陈宇综等应用INVDOCK进行反向对接寻找中药中具有潜在抗肿瘤活性化合物的作用靶点。研究中首先选取了3个文献中已经报道的中药提取物山油柑碱、黄芪苷以及大黄素作为研究对象,其抗肿瘤作用均已被证实。通过查找药理学资料从PDB中选取与抗肿瘤作用有关的蛋白质,并利用设定好的对接位点条件对数据库进行过滤,进一步缩小数据库规模。最后将3个化合物分别对候选的蛋白质数据库进行对接筛选,结果发现了3个化合物各自的抗肿瘤靶点。其中来自植物降真香的山油柑碱主要靶标为DNA聚合酶、β-catenin蛋白和醛糖还原酶;从黄芩中分离的黄芩苷有14个潜在的抗肿瘤作用靶点,其中两个已经通过实验得到证实,分别是DNA聚合酶和醛糖还原酶,余下的还未得到实验确证;而从植物大黄中提取的大黄素作用于蛋白激酶C、环腺苷酸依赖性蛋白激酶以及消炎靶标kappa-B。郑春松等则通过选择扶正抑瘤方和清热消症饮为研究对象,并结合临床使用情况,利用分子对接的方法对中药活性成分进行研究。首先选择复方中灵芝、女贞子、夏枯草及白花蛇舌草作为对象,并依据文献报道构建出复方中包含的化合物小分子库,共计285个结构。通过药理、药化等有关资料,选择了部分已经得到确证与治疗肿瘤有关的靶标,结构均来自于PDB库。对接采用Accelrys公司提供的Cerius2分子设计软件包,通过各靶标与构建的小分子数据库进行对接,结果发现复方中4个单味中药自身具有多靶点效应,而且各味药之间又存在对同一靶点相互协同以及不同靶点之间相互补充的作用。如灵芝中的化学成分作用的靶点包括表皮生长因子受体、抑制凋亡基因Bcl-x1、肿瘤坏死因子α、细胞周期依赖性蛋白激酶2;而女贞子中化合物的作用靶点除上述外还作用于血管内皮生长因子受体2、白细胞介素-2以及环氧化酶-2等。由此,进一步说明了对消化道肿瘤选择扶正抑瘤方和清热消症饮联合使用,疗效更为显著。3.2糖敏灵丸在型糖尿病治疗中的应用针对Ⅱ型糖尿病的治疗,现有的药物只能从症状上对疾病进行调节,但却不能根治,这在于糖尿病致病机理比较复杂,涉及的蛋白靶标众多,因此普通药物只能对其中某一环节发挥作用。最近由天津天士力公司开发的中药制剂糖敏灵丸临床上被证明能明显改善新诊断Ⅱ型糖尿病伴代谢综合征患者的各项指标,保护胰岛β细胞功能。该制剂由11味中草药组成,包括:柴胡、柑橘、大黄等。北京大学的许筱杰等在中药对Ⅱ型糖尿病治疗的“网络靶标”课题研究中,对糖敏灵丸进行了分析。复方中的11味中药成分共包含676个小分子化合物,它们的结构全部来自于贝尔斯坦(Beilstein)数据库以及中草药数据库(CHDD),与Ⅱ型糖尿病相关的37个蛋白靶点从蛋白质数据库(RSCBproteindatabank)获得。虚拟筛选采用了Cerius2软件中的flexibledocking程序,将37个靶点分别与676个化合物进行对接。然后利用Cytoscape2.8.1软件分别建立药物-靶标网络以及药物-药物关联网络,在D-Tnetwork分析中,药物与靶标关系的建立前提是某个化合物与其中一个靶点对接结果得分在前20名以内;而D-Dnetwork分析中,2个小分子间是否关联取决于它们是否同时对某一个或者更多的靶点有效。最后发现糖原合成酶激酶-3β、蛋白激酶C以及胰高血糖素样肽-1受体等与疾病的关联较之其它靶标更为密切。而且,分析结果表明复方中起关键作用的某些化合物有些已被报道具有降糖作用,其它一些如大黄二蒽酮(rheidin)A、番泻叶甙、前青花素C1等则很可能具备潜在对抗Ⅱ型糖尿病活性。由此证明中药复方中的多组分,并同时对多靶点进行干扰可能是其发挥疗效的根本原因。3.3中药传统模型的建立药效团是一种基于配体的常用研究方法,张燕玲等在现代药理研究基础上,利用药效团筛选方法,对活血化瘀类中药的作用靶点进行了探讨。已有研究发现中药在防治心血管疾病方面基本通过改善微循环、改善血液流变学以及抗血栓形成等方面发挥作用,因此张燕玲等选择了多种相应的心血管受体作为研究对象,其中包括血管紧张素转化酶(angiotensinconvertenzyme,ACE)受体、血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)受体、血小板激活因子(plateletactivatingfactor,PAF)受体以及5-羟色胺受体。作者首先对已经明确具有活血化瘀功效的27味传统中药进行归纳,构建出相应的中药化学成分三维结构数据库,用于虚拟筛选。药效团的构建采用Accelrys公司开发的Catalyst软件,对上述4个ACE、AngⅡ、PAF、5-HT心血管受体抑制剂药效团进行识别后,则分别对先期构建的数据库进行药效团筛选,命中结果显示在27味中药中有7味具有潜在的ACE、AngⅡ、PAF、5-HT受体拮抗活性,从而对中药的作用靶点及机理进行了解释,并且从另一侧面验证了所构建药效团模型的合理性。研究最后将该药效团模型对邓中甲主编的《方剂学》中列举的18首活血化瘀方剂进行虚拟筛选,其中包括桃核承气汤、大黄蜇虫汤等名方,结果显示18首方剂中的65味中药中,有19味包含ACE、AngⅡ、PAF、5-HT受体拮抗剂活性成分,进一步阐释了方剂整体疗效的物质基础和作用机理。4不同结构的配体分子身份证研究中药因其成分复杂、作用机理不明确等原因,阻碍其创新与发展,进而影响了其走向世界的进程。随着越来越多的医药工作者投身于中药现代化研究中,各种先进的技术应运而生,比如基因工程技术、酶工程技术等,都对中药研究做出了巨大的贡献。计算机辅助药物设计作为一种新型的药物研究手段,其特点之一便在于使用计算机模拟方法揭示出药物与其受体之间的关系。而CADD技术用于中药复方的研究中,即是传统与现代技术的一次有效的融合,其可行性也已经得到实践充分证明。CADD技术作为对中药研究的一种有益尝试,必将与其他研究手段一起推动我国的中医药事业不断向前创新与发展。分子对接(moleculardocking)是依据配体与受体作用的“锁-钥原理”,模拟小分子配体与生物大分子受体相互作用。配体与受体相互作用是分子识别的过程,主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等。蛋白质数据库(proteindatabank,PDB)专门收录蛋白质及核酸三维结构,目前该数据库共包含77878个结构,并且每年仍以较快的速度增长。利用这一有效的结构数据资源,有学者应用“反向对接”方法进行中药有效成分靶标的确认。其中,TarFisDock程序是利用一个小分子(药物、先导化合物或者天然产物)与蛋白质数据库中的蛋白质进行对接,并且每个对接结果都进行打分,最终按得分排序结果挑选出2%的候选蛋白质定为潜在的靶标,进而利用蛋白质组学方法对靶标蛋白进行验证,依据用药前后影响蛋白质表达的变化最终筛选出可能的作用靶点。TarFisDock可以提供一定的信息来指导实验,在一定程度上弥补实验能力的不足,从而对中药作用靶标的确认提供一定的帮助,辅助中药现代化。系统生物学表明许多复杂的疾病,如:癌症、心血管系统疾病,其致病并非由单纯某一因素引起,而是诸多基因缺陷累加的结果,因此可以推测某一疾病可以对应存在多个作用靶点。近年来多向药理学(polypharmacology)和网络药理学(networkpharmacology)的兴起给当今新药