超声波与腌制联合提取核酸的研究

超声波与腌制联合提取核酸的研究

核糖核酸（ribenson，rn）是生物中的一种重要化合物。RNA对维持机体的正常功能有重要作用，是特定生理条件下不可缺少的营养成分。外源性核酸在机体营养、免疫调节和疾病防治等方面都有一定的功能。另外,核酸在国民经济中有着重要用途,它涉及食品、医疗、农牧业和生化试剂等领域。某些核酸类物质作为营养保健食品的添加剂,对促进儿童的生长发育、老年人的减缓衰老和身体虚弱的病后康复均有一定效果；在农牧渔业中，核酸类物质作为植物生长刺激剂和饲料添加剂获得了明显的经济效益；在医药界，一些核酸类药物正在许多领域发生重大影响，成为治疗冠心病和病毒性疾病的主要药物；在科研中，核酸类药物作为生化制剂已达数百种。目前，我国核酸生物技术工程项目亟待加速开发，以扭转我国核酸原料依赖进口的状况。专家们指出，要加速我国核酸产业的发展，应加快开发核酸原料，搞好综合利用。我国是啤酒生产大国，啤酒生产中会带来大量的废酵母，啤酒酵母含有丰富的RNA,主要分布在细胞质内,含量达2%～8%，在本文中主要讨论从啤酒废酵母中提取核糖核酸的方法，对酵母进行综合利用。1材料和方法1.1材料表面啤酒废酵母：由河北新世纪酿造有限公司提供；氯化钠、盐酸、氢氧化钠、钼酸铵、高氯酸等为分析纯。1.2主要设备LG10-2.4A离心机，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，UV-2102型分光光度计，pH计，SCT-3A快速水分测定仪。1.3实验方法1.3.1原材料预处理1.3.2工艺1.3.3测定含酸量1.3.3.石英比色法取一定量处理好的酵母泥，用5%高氯酸在100℃下水解15min,3600r/min离心15min，取上清液，用石英比色皿，在260nm,280nm光柱1cm，测OD值。其中0.024是浓度为1μg/mL的RNA溶液的OD值。1.3.3.核酸量的测定核酸类含有双键的物质在260nm处具有最大紫外吸收。把离心后的上清液稀释到合适的浓度，测定其在260nm处的紫外吸收值，计算上清液中的核酸量。核酸含量（mg）=×上清液体积×稀释倍数×10-3其中0.024是浓度为1μg/mL的RNA溶液的OD值。1.3.3.离心分离测量取两个试管，按照表1加入，混匀，冰水浴中放置30min，离心分离，上清液测量A260nm。2号试管的OD260为总的核酸、核苷酸碱基的吸收值,1号试管的OD260为核苷酸等小分子的吸收值，两者之差即为核酸大分子的值。1.3.4取酸纯度的提取纯RNA溶液的A260/A280比值为2.0，样品中若含有蛋白质,则A260/A280比值将下降。1.3.5超声时间对沉积物提取的影响在不同的超声时间下对啤酒废酵母进行核酸提取，测定提取上清液中的核酸含量和纯度，并计算核酸的提取率。1.3.6超声波功率对原子能提取的影响在不同的超声波功率下对啤酒废酵母进行核酸提取，测定提取上清液中的核酸含量和纯度，并计算核酸的提取率。1.3.7母浓度对提取氨基酸的影响考察不同酵母浓度时，超声波提取核酸的效果。1.3.8超声和盐处理法的结合提取核酸的效果在不同食盐浓度下对酵母中的核酸进行超声波提取，测定提取上清液中的核酸含量和纯度，并计算核酸的提取率。2结果与分析2.1超声时间对沉积物提取的影响对溶液超声以不同时间来检测上清液中的核酸，结果见图1。2.2提取出的核酸纯度降低在酵母浓度分别为5%和10%时，对溶液超声提取核酸，结果见图1。由图1可看出，随着超声时间的延长，核酸的提取量和核酸的提取率均增加，但是提取出的核酸的纯度略有下降。原因可能是，随着超声时间的延长，酵母细胞的破壁率增大，同时有利于核酸和蛋白质的渗出。由图1还可知道，低酵母浓度有利于核酸的提取，但是在酵母浓度增大的同时延长超声破壁时间有助于提取高浓度酵母中的核酸并增加核酸最终提取的纯度，但低浓度的酵母溶液却随着超声时间的延长提取核酸的纯度呈下降趋势，分析原因可能是长时间的超声破壁使得低浓度酵母溶液中的蛋白开始大量释放。2.3超声波功率对提取出的核酸的影响对酵母溶液采用不同的超声波功率提取核酸，结果见图2。由图2可知，随着超声波功率的增大，提取出的核酸在增加，同时核酸的纯度却逐渐下降。分析原因可能是由于高强度的超声波对酵母细胞的细胞壁损伤较严重，对核酸和蛋白的溶出均起促进作用。2.4两种提取核酸效果的比较对超声波单独作用和它与不同浓度食盐协同作用酵母提取核酸的效果进行比较，结果见图3。由图3可知，在超声波提取酵母核酸时，加入低浓度的食盐有助于提取核酸，但是食盐浓度过高，核酸的提取效果会降低。2.5试验结果分析对超声波和食盐联合破壁的条件进行试验，按照以上因素水平采用L16(45)正交设计进行实验，因素水平设计见表2，正交试验结果见图4。对数据进行方差分析其存在显著性，结果见表3。由正交实验及方差分析可以看出，酵母浓度、破壁时间、破壁功率对核酸的提取率影响很大，氯化钠浓度对核酸的提取率影响不算显著；酵母浓度对总核酸量的影响显著。综合实验结果可知，超声波与食盐结合提取核酸的最佳条件为：酵母浓度3%，破壁时间为35min，破壁功率为90W，食盐加量为1.3%。3超声波提取核酸3.1对超声波提取酵母核酸