复方斑胶囊血清对smmc-7721细胞蛋白质组的影响

复方斑胶囊血清对smmc-7721细胞蛋白质组的影响

虽然复方板的肿瘤机制非常独特，但其在骨髓中的抑制作用非常好，同时对白细胞的转化起到了很好的作用。但由于中药多组分、多途径、多靶点的作用特点,同时缺乏反应中药特色的研究思路和技术支撑,致使其作用机制的研究鲜见报道。本研究将中药血清药理学与蛋白质组学相结合,摒弃方剂的药效物质基础,直接探索复方药物对靶细胞的作用,利用中药血清药理学方法制备复方斑蝥胶囊血清处理SMMC-7721细胞来模拟口服抗癌药体内杀伤癌细胞过程,用蛋白质组学技术观察受药物影响出现表达差异的蛋白质,通过对差异蛋白质的鉴定,找出可能介导复方斑蝥胶囊作用的生物分子、作用靶点。本研究的目的旨在发现复方斑蝥胶囊抗肝癌的分子作用机制。1试剂和仪器人肝癌细胞株SMMC-7721由上海肿瘤研究所建株,重庆医科大学感染实验室惠赠。新西兰大耳白兔,体重为(2.5±0.2)kg,雌雄不限,由重庆医科大学实验动物中心提供,许可证号SCXK(渝)20020001。低相对分子质量蛋白标记物,丙烯酰胺,三羟甲基氨基甲烷,二硫苏糖醇(DTT),硫脲,十二烷基硫酸钠,甘氨酸,IPG干胶条(pH3~10,17cm),Bio-lyte(pH3~10)购自美国Bio-Rad公司;超纯脲,四甲基乙二胺(TEMED),丙基硫酸盐(CHAPS),苯甲基磺酰氟(PMSF),三氟乙酸(TFA),碘乙酰胺,a-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA),AngiotensinⅡ(human),ACTHfragment18-39(human),考马斯亮蓝R-250,G-250购自Sigma公司;乙腈(ACN)色谱纯购自Tedia公司,Trypsin购自Promega公司;其余试剂均为国产分析纯。复方斑蝥胶囊由重庆希尔安药业有限公司惠赠,国药准字ZI9993409,批号040901。美国Bio-Rad公司配套电泳仪:IPGphor等电聚焦仪、PROTEANⅡXLCell电泳系统、图像分析软件PDQuest7.3software,MultiTempⅢ水浴冷却系统(美国AmershamPharmacia公司),基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱仪(MALDI-TOF-MS)(美国ABI公司)。2方法2.1复方斑胶囊的制备人肝癌细胞SMMC-7721接种在含10%灭活的新生小牛血清的RPMI-1640培养液中,置37℃,5%CO2孵箱中培养,每2~3d用0.1%胰酶消化传代。处理组动物的临床等效剂量的给药剂量按下列公式计算。临床等效剂量的动物给药剂量=临床用量×等效剂量系数(按体表面积计算)×培养体系血清稀释度等效剂量系数=S兔/S人动物体表面积和体重之间的关系式:lgS=0.8762+0.698lgWS为体表面积(cm2),W为体重(g),人标准体重按70kg计算,试验用兔体重为2.5kg,复方斑蝥胶囊的临床用量为1500mg·d-1,培养体系血清稀释度为10。用20mLPBS(pH7.4)将3倍临床等效剂量的复方斑蝥胶囊内容物制成混悬液,给药组兔连续灌胃3d,于末次给药后3h时刻以心脏采血法收集药物血清,对照组兔连续灌以无药PBS溶液3d,同法收集对照血清。同组血清混合,经56℃30min灭活补体,0.22μm微孔滤膜过滤除菌于-20℃保存备用。将含药血清和对照血清用含10%小牛血清的RPMI1640培养液配成10%的药物血清孵育液和对照血清孵育液,并用此孵育液处理细胞72h后分别收集对照细胞和处理细胞,预冷PBS洗涤后离心去上清,重复3次,液氮冻融3个循环,加入RNA酶(5μg·mL-1)和DNA酶(20μg·mL-1),4℃冰浴30min,再加入5倍细胞体积的裂解液(7mol·L-1尿素,2mol·L-1硫脲,4%CHAPS,40mmol·L-1Tris,65mmol·L-1DTT,1%Biolyte,1mmol·L-1PMSF)振荡5min后,25000×g,4℃离心60min,收集上清液,Bradford法定量蛋白后-70℃保存。2.2sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳按Bio-Rad公司双向电泳手册进行,胶条选择pH3~10,长度17cm的线性胶,蛋白质上样量为1000μg(350μL),胶条水化聚焦在17℃自动进行,经被动水化14h,250V,1000V除盐后线性升压到1万V,最后稳定在1万V聚焦达6万V·h,再将胶条经两步平衡后转移至12%的均匀胶上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,10mA/gel恒流40min至溴酚蓝完全跑出IPG胶条成一条线,再按40mA/gel恒流电泳至溴酚蓝前沿达玻璃板底部停止,考马斯亮蓝R-250染色。2.3强化光催化作用染色凝胶采用NikonD100+AF-SNIKKOR17-35mm1∶2.8D数码相机拍照,利用PDQuest7.3软件产生吸光度图像(makeAimage),经强度校正、背景消减、点检测,归一化和匹配等分析。并根据吸光度的变化来判断蛋白斑点表达量的变化,对复方斑蝥胶囊血清处理细胞和对照细胞的2-DE图谱进行分析后,选取具有2倍以上量变的蛋白质点作为进一步质谱分析的候选蛋白。2.4tfa溶液配制将差异表达的蛋白质点从胶上切下,经50%ACN/25mmol·L-1碳酸氢铵水溶液脱色、ACN脱水至胶块变白,真空离心干燥、Trypsin酶切16h后,用50%ACN/5%TFA水溶液萃取2次,将萃取液冷冻真空抽干后以3μL50%ACN/0.5%TFA水溶液复溶,加入过饱和基质溶液3μL,混匀后取2μL点样于不锈钢靶板上,空气自然干燥后备用。在MALDI-TOF-MS上进行分析,采用反向模式,正离子谱测定,离子源加速电压为20kV,波长337nm,脉冲宽度为3ns,离子延迟提取70~85ns,真空度为4×10-8Torr,质谱信号单次扫描累加50~100次,并用ABI公司提供的Mix1肽混合物C、AngiotensinⅡ和ACTHfragment18-39对照品为外标,胰酶自显峰842.51、角蛋白峰1993.94为内标校正质谱峰,得到肽质量指纹谱,采用Mascot搜索引擎搜索NCBInr数据库。3结果3.1维凝胶图谱的建立利用双向电泳分离药物血清和对照血清处理72h的SMMC-7721的全细胞蛋白质,第一相用pH为3~10,长度为17cm的线性胶,第一相结束后进行SDS,考染后获得二维凝胶图谱。利用PD-quest7.3软件分析共检测到了大约450个点,药物处理细胞和对照细胞蛋白质图谱间的相关性为72%,2倍以上量变的有47个点,差异蛋白点主要集中在pH4~7内。3.2蛋白点表达情况根据图像分析,选择了13个差异点进行MALDI-TOF-MS分析,其中7个蛋白点(3,5,6,8,9,11,13)受药物影响表达显著上调,其余6个蛋白点(1,2,4,7,10,12)表达显著下调(图1,2)。经数据库检索,有4个蛋白质点得到了鉴定。数据库匹配结果见表1。4复方斑胶囊的药效根据前期试验,选择比较3倍临床等效剂量连续给药3d末次给药3h的含药兔血清处理72h的SMMC-7721细胞蛋白质和对照细胞蛋白质。研究结果发现,复方斑蝥胶囊作用癌细胞SMMC-7721导致真核翻译起始因子5A(eIF-5A)和硫氧还蛋白过氧化酶2(PRDX2)表达显著下调,膜联蛋白A5(Annexinv)和热休克70×103蛋白(HSP70)表达显著上调。eIF-5A是目前已知唯一含hypusine(8-羟基2,7,10-三氨基癸酸)的细胞内蛋白质,是维持细胞生存必不可少的成分。在低分化、12/13密码子K-ras突变、p53核蓄积的肿瘤中发现有eIF-5A高表达。它被认为是抗肿瘤治疗的重要靶标之一。在研究α干扰素诱导人表皮咽癌KB细胞和肺H1355癌细胞系凋亡时发现GC7(eIF-5A灭活物)对其有协调作用。另有研究发现利用DAH(eIF-5A的灭活物)处理白血病细胞系Mo7e,TF-1和THP-1和人乳腺癌细胞系MCF-7可诱导细胞凋亡阻滞在G1-S期的分界。前期的研究发现复方斑蝥胶囊血清诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡阻滞在G0-G1期,可能与该药靶向下调eIF-5A的作用有关。PRDX2是作用在Bcl-2的上游的抗凋亡蛋白,能够阻止细胞中过氧化氢蓄积、抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆并能抑制磷脂过氧化反应,保护细胞抵抗血清饥饿、神经酰胺、鬼臼乙叉苷等诱导的凋亡。本研究中药物处理细胞出现PRDX2表达下调与前期证实的处理组细胞出现Bcl-2表达下调的结论相一致,说明下调PRDX2可能是复方斑蝥胶囊促进癌细胞凋亡的机制之一。Annexinv是抗肿瘤增殖的一种蛋白质,其通过抑制蛋白激酶C(PKC)和磷脂酶A2而发挥抗增殖作用,抑制PKC的活化还可对抗由于PKC活化而加速P-糖蛋白的磷酸化所致的肿瘤细胞多药耐药的发生与发展。本研究发现处理组细胞中Annexinv表达明显上调,表明复方斑蝥胶囊不仅能够抗肿瘤增殖,还可通过抑制耐药性的产生提高自身及其他联用药物的抗肿瘤活性。关于HSP70蛋白,目前有两种不同的观点,一种认为它是抗凋亡蛋白,可与多种癌基因产物结合形成HSP70-癌蛋白复合物,从而介导癌蛋白构象成熟及转运,维持癌细胞结构与功能的完整。但亦有文献证实诱导HSP70高表达能够阻止促炎症反应抗凋亡因子——NF-kappa-B的活化和核转运,通过增强抗肿瘤免疫的能力从而促进癌细胞凋亡。本研究中处理组细胞出现HS