癌症检测新方向液体活检

液体活检介绍在我国癌症筛查成果中，只有20%是早期，80%的癌症查出来都是中晚期了，而这20%的癌症早期还是体检查出来的。”众所周知，癌症越早发现治愈率越高，但患者缺少对应的筛查手段，体检得来的报告成果，其敏捷度和精确度都相对较低。如今在美国，一种被称为液体活检的检测办法正开始兴起，为某些病人省去了手术活检和穿刺活检，这两种活检是长久需要来指导病人癌症治疗的。现在国内也有某些生物公司在研发液体活检技术----只需抽取6~8ml血，就能筛查与否患有6大常见癌症（肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、大肠癌、乳腺癌），精确率超出80%，耗费约～3000元。液体活检是什么？真的像宣传的那么有效么？液体活检作为体外诊疗的一种分支,是指一种非侵入式的血液测试,能监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)碎片,是检测肿瘤和癌症、辅助治疗的突破性技术。它的优势在于能解决精确医疗的痛点,通过非侵入性取样减少活检危害,并且有效延长患者生存期,含有高性价比。液体活检技术重要涉及CTC和ctDNA，以及外泌体检测。基因突变是肿瘤产生发展的重要因素，几乎全部癌症患者都携带有DNA突变，这些突变只存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞，因此为肿瘤组织的检测与跟踪提供了方便的特异性生物标记。种类繁多的突变位点及基因型也为肿瘤的精确诊疗提供了必要的信息。1.液体活检尚不能用于肿瘤早筛。早筛是指对肿瘤的预测，以及早期肿瘤的检查。由于只有当肿瘤生长到一定阶段后，CTC或者ctDNA进入血液，才干通过液体活检的方式检测出来。而此时，肿瘤往往已经生长到一定规模，不再是早期肿瘤了。2.液体活检技术不是传统检查的替代技术。肿瘤的初步诊疗、确诊和疗效评定，应当根据实际状况，结合影像、肿瘤标志物和液体活检等检查方式综合判断。液体活检在一定程度上解决了传统技术的部分局限性，但尚局限性以替代传统检测技术。液体活检介绍1.循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells,CTCs）循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells,CTCs）是游离于血液循环系统中的肿瘤细胞，来源于原发肿瘤组织，是肿瘤细胞转移的重要方式，也是肿瘤患者术后复发的重要因素，同事还是激发癌症致死机制的重要因素。CTC作为肿瘤细胞，不仅包含肿瘤的DNA信息，同时还包含基因组、蛋白质组等信息，是研究肿瘤组织信息的丰富来源。（1）二代CTC检测技术1.密度梯度离心可将CTC与红细胞白细胞分离，根据不同密度沉降在不同区间而进行分离。现在市场上有较多的这种类型的试剂盒，Ficoll-paquesolution（PharmaciaFineChmeicals，Sweden），OncoQuick等。2.过滤法根据CTC体积大雨血细胞的特性，对CTC进行捕获。CTC的直径约为10~20um，而血细胞大小为7~12um，通过过滤，留下体积比较大的CTC.随着对CTC研究进一步，发现诸多CTC与白细胞大小类似甚至只有它二分之一或者更小。这些小或者超小CTC的数目比例在某些肿瘤中可高达三分之一。3.微控流芯片针对CTC的体积和可变形性对CTC进行捕获，CTC的捕获率和特异性可达成80%以上。不仅能够检测CTC的数量，并且能够分离活细胞进行其它分析，是将来CTC检测的发展方向，微流控芯片内CTC的分选富集办法重要分为生物化学办法和物理分离法。生物化学办法指的是选择特异性抗体对细胞表面体现的标志物进行特异性的抗原抗体吸附，达成分选的目的，物理法重要应用外力场（电、磁场、流体场、超声波等）基于细胞间的物理特性差别（大小、变形性、密度、介电性等）进行分离。4.其它分离办法核心原理还是运用CTC免疫学和物理学特性，但是缺少临床数据验证。（2）CTC临床应用1.辅助诊疗。重要是在常规手段无法对早期肿瘤进行判断时进行。2.疗效评定。癌症患者进行化疗、靶向治疗后进行CTC检测，若CTC数量减少，则提示治疗方式可能有效，相比于现阶段的CT、MRI等检查手段，CTC检测技术操作更方便，应用更简朴，能够更及时地提示医生该患者与否适合化疗或者靶向治疗。3.术后监测。以肺癌为例，肺癌患者手术后约50%可能复发，术后监测非常重要，现在重要监测手段是3或6个月进行CTC检查，因活检无法高频次检查，而CTC能够克服这个缺点，及时检测血液中CTC的变化，在癌症发生的早期就及时进行治疗，能提高患者存活率。2.血浆游离肿瘤DNA(Cell-Free'CirculatingTumorDNA，ctDNA)ctDNA:是指人体血液循环系统中不停流动的携带一定（涉及突变、缺少、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等）来自肿瘤基因组的DNA片段。CtDNA的重要来源涉及：1.来自坏死的肿瘤细胞2.来自凋亡的肿瘤细胞3.循环肿瘤细胞4.来自肿瘤细胞分泌的外排体。cfDNA最成熟的应用是NIPT（无创产前基因检测），抽取孕妇静脉血分析胎儿游离的片段DNA，判断胎儿患唐氏综合征（21、18、13三体综合征）的概率。已经是国内常见的优生优育筛查手段。对ctDNA的分析涉及定性和定量的分析，其中定性分析涉及检测基因突变、缺失、插入、融合、重排、拷贝数变异、甲基化、微卫星不稳定（MSI）和杂合性缺失（LOH）等，定量分析就是计算ctDNA在血液中实时的含量，定性和定量均可反映肿瘤的存在和严重程度。理论上说，一种细胞含有约6~7pg的DNA,1ml血能提取10ng游离DNA,相称于来自约~3000个凋亡细胞的DNA量，但是普通状况下只占整个循环DNA的1%，甚至0.01%。因此，这对DNA的检测技术提出了比较高的规定。现在国内外均没有成熟产品，重要有两个方向：一是应用测序技术直接获取ctDNA序列信息，另外运用DNA扩增技术（PCR）检测包含特定序列的ctDNA的浓度。ctDNA的技术发展能够预测向着高精度和高通量的方向发展。NGS由于其价格因素，将来还是用于研发，因此最新的研究都集中在富集靶向DNA,将富集后的DNA做深度测序能够大幅度减少成本，但是如何高效精确的富集目的DNA序列仍旧是ctDNA检测的瓶颈。因此还是处在前期发展阶段，离真正走向临床尚有一段距离要走。3．外泌体外泌体（exosome）是细胞分泌出的小泡，小泡中包含蛋白质、DNA、信使RNA以及某些非编码RNA，是细胞之间沟通的载体，研究发现这些外泌体与肿瘤的发生、发展、转移以及抗药性含有一定的有关性。肿瘤细胞以这些小泡为载体协助其逃过免疫系统的监视，这些小泡首先给肿瘤细胞的转移指导方向，另首先也发明适合肿瘤生长的微环境。外泌体携带的信息多样化。其中的蛋白质和核酸，均可用于癌症的早诊、复发监测、抗药性监测等有关方面的分析。并且外泌体在数量上多于CTC,更容易富集，在形式上分泌小泡能够有效保护核酸类物质，克服了ctDNA在血液中易降解的问题，在临床应用上有广泛前景。但是外泌体的研究尚处在临床早期，参加公司较少。4．液体活检技术比较二、市场现状癌症液体活检作为基因测序产业下的一种细分领域，与基因测序有着非常相似的产业链模式。现有基因测序产业链分为上游仪器与耗材生产销售公司，中游检测服务提供公司，以及下游数据分析公司，由于单纯提供测序服务技术门槛不高、竞争激烈，造成中游测序服务公司利润微博。故国内大多数有能力的测序服务公司都自行提供成果分析服务，在肿瘤基因检测领域更甚。基因测序公司提供的肿瘤检测报告几乎都会提供有关的基因突变位点分析，供医生参考，因此，肿瘤液体活检产业链能够划分为上游器械耗材公司和中下游监测分析公司。上游公司的核心竞争力是技术。提供核心技术的CTC分析仪、数字PCR仪、二代测序仪及配合使用的试剂盒核心技术掌握在国外几个公司手里，并且技术壁垒较高，专利保护严格，这几个国外大公司相称于垄断瓜分大部分市场。在国内基因测序行业中，国外仪器提供商的议价能力很强，为摆脱这种影响，部分国内公司奋发图强，尝试自主研发仪器耗材或者通过重组并购上游公司。已有几家国内公司通过并购实现二代测序仪的生产。但在比拼核心技术方面，国内“山寨版”性能与同功效的国外版性能有不小的差距，并且国内产品同质化严重，竞争激烈。目国内的肿瘤液体活检也绑上了火箭般的速度发展。据不完全统计，自以来成立做二代测序的公司都达成了200多家，而开展肿瘤液体活检多数采用二代测序技术对ctDNA进行分析。因此液体活检早期发展阶段，在肿瘤组织活检市场上有强势销售地位的公司如若紧跟CTC、ctDNA的潮流，发挥原有市场的作用，对其进行部分产品替代，即可快速抢占液体活检市场份额。即谁有渠道进入医院就能占山为王。中下游公司的竞争点除了销售渠道，就剩余数据解读分析能力了。样本量越大、信息越全方面来源数据越可靠的数据库必然更受市场青睐。国内的基因测序公司都在主动积累自有数据库并优化基因数据的解读分析能力，但都没有形成绝对优势，行业原则也有待建立。审批制度在美国的医疗器械拿到临床准入有“双通道制”，第一是能够通过FDA认证，拿到临床准入，产品能够在市场上推广和销售；二是获得CLIA认证的实验室，能够实现临床实验室的消费级和科研应用。CLIA实验室能够根据市场的现实需求，快速地开发实验室自建项目，并通过在临床上的应用给与可靠的临床指导。CLIA认证解决了基础研究和临床应用之间低效率转化甚至脱节的问题，对转化医学和研究成果转化有非常重要的意义。美国大部分液态活检公司都是走CLIA认证而非FDA认证。国内也借鉴这种方式来规范基因检测公司的竞争。国内的基于基因检测的液态活检项目进入临床也实施双重监管，全部仪器设备，试剂归CFDA报批管理，临床实验室归属卫计委这与美国CLIA认证制度类似，即规定试点单位内部有严格的质量控制，并且有关工作人员需经培训合格上岗，则不受CFDA对仪器和试剂的注册限制。将来ctDNA的发展将会严重依赖渠道资源及疾病样本资源，且CFDA对产品临床资质的管理也将越来越严格，将来ctDNA公司最可能的业务模式为：①国家同意的临床应用试点单位自行进行临床实验，类似于美国CLIA实验室；②不含有试点资格的公司通过与医院合作，获取医院外包服务资质，但以科研服务为主；③不含有试点资格的公司通过与医院合作，自行进行诊疗试剂盒报批，并把产品投向医院。值得注意的是，现在获得同意的临床试点单位数量较少，对应的样本量也受限，在大量ctDNA公司激烈竞争市场蛋糕的状况下，获得入场券、确保渠道及样本优势将会非常核心。因此，技术、渠道资源在ctDNA领域仍然缺一不可。国家政策支持从精确医疗概念的提出，国家就制订了一系列战略计划主动激励以DNA测序为基础的精确医疗。3月科技部召开国家初次精确医疗战略专家会议，提出在2030年以前投入600亿元用于精确医疗。同月卫计委公布《国家卫生计生委医政医管局有关肿瘤诊疗与治疗项目高通量基因测序技术临床应用试点工作的告知》，涉及14家医疗机构和6家第三方检查实验室。另外公布以肿瘤个体化治疗、药品代谢酶及作用靶点基因检测的技术指南，旨在规范化推广有关技术。4月国家发展改革委员会下发了《有关第一批基因检测技术应用示范中心建设方案的复函》正式批复27个省市发改委有关基因检测技术应用示范中心的建设方案，从审批进度来看，将来示范单位的审批已经逐步放开。这一系列政策的出台显示出政府对肿瘤基因测序从资金到监管的全方位支持，也奠定了肿瘤基因测序的高端发展路线。国内外液体活检现有产品液体活检临床应用方向、现状及展望3月《第13届中国肺癌高峰论坛会议》专家共识中也提到了有关液体活检：（1）本次颁布的共识，首先将共识的级别进行了分类，由于液体活检属于新生事物，在许多判断上全球也没有统一的原则，因此首先将共识级别进行分类，为将来共识的进一步升级奠定了基础；（2）共识二将液体活检范畴扩大到了CTC、ctDNA和外泌体。随着免疫治疗对人群精确治疗的需求，将来相信针对肿瘤特异性免疫细胞和有关基因组序列特性的检测，用以展开免疫治疗疗效的评定会纳入共识二的更新版本中；（3）共识三提到NGS的优势在于检测多个基因变异，随着某些靶点的复杂变异形式出现，期待将来的共识会从描述靶点转为描述变异位点，单个变异位点可能使用传统的检测方式更加适宜，而即使是单靶点碰到复杂变异形式（如无热点突变），使用NGS更加适宜；（4）共识四提到NGS亦可用于研究探索，是其一种巨大优势，相信将来结合其它液体活检技术探索临床预后和监测疗效也会写进共识；（5）共识五非常全方面的关注到了早期筛查和术后复发监测，且提到现在无论是CTC还是ctDNA用于早期筛查都都仅限于科研探索。由于技术的限制，现在确实存在证据局限性问题。随着时间进步，相信在2-3年内，不仅新的检测技术会纳入到共识五中，且应用也会进入临床实践级别；（6）共识六专家在2A级别共识了NGS检测要平衡患者利益、伦理和科学探索之间的关系，这是现在精确医疗的一种重要特点，每个患者都是数据点，每个数据点都可能通过科学探索奉献医学和临床，因此平衡好三者关系是推动精确医疗良性发展的重要基础。任何技术的临床应用转化都会经历三个阶段：1.技术性能指标确实认；2.临床应用可行性的评定；3.临床产品的转化及落地。现阶段，液体活检技术整体还处在第一阶段到第二阶段的过渡中。液体活检的内容包含cfDNA、CTC和外泌体，但其实技术成熟度、应用广泛性、法规支持等方面有很大差别，现在在临床实际应用中，ctDNA仍是现在最惯用的液体活检。并且，不管是NGS还是ARMS-PCR，现在应用较多的还是针对明确已知的体细胞突变进行靶向药品治疗的指导。对于多线治疗失败后无法取组织的患者进行液体活检对于探索耐药机制，进行疗效监测。NGS相比传统办法有巨大优势。但是在技术尚未完善和原则化之前，野蛮生长的产业可能会带来区域性的失控。那么液体活检走到临床，尚有哪些问题需要解决？（1）技术层面首先，CTC和ctDNA检测手段有待进一步提高。CTCs仅少量存在于外周血，且异质性很大，因此CTC的分离技术还面临着诸多挑战，现在尚未找到特异的CTCs的表面标志物，因此依赖表面标志物的分离方略难以避免假阴性的出现，多个生物、物理技术被用来分离CTCs，使得CTCs的得率有了很大的提高，但是不同技术的原理不同，造成分离得到的细胞也各异，对CTCs的认识还处在盲人摸象的阶段，改善和规范化CTCs的分离技术显得至关重要。现在ctDNA检测惯用驱动基因的检测，如外周血EGFR突变检测，尽管含有高的特异性，但是敏感性徘徊于50%~70%左右，成为ctDNA检测临床应用的瓶颈。另首先，基因突变、表观遗传学变化和基因差别体现是个体化诊疗的重要检测目的。对应的检测技术涉及等位基因特异PCR、甲基特异PCR，芯片技术和NGS；其原理和技术参数都有不同。在临床应用中，只有较好的将样本类型与有关检测技术相匹配才干获得最优化的临床产品。满足可并行检测体细胞基因单一位点突变、基因扩增和融合等多个突变类型，减少样本用量。综合分析现在惯用技术不难发现，真正符合这一规定的技术并不多，如惯用的等位基因特异PCR技术敏捷度在1～10%左右，可基本满足肿瘤组织基因检测的规定，但在基因突变丰度如此低的液体活检样本面前却显得束手无策；ddPCR技术敏捷度能够达成0.1‰，能够用于低丰度基因突变检测，并已经成功应用于血浆EGFR检测。但ddPCR只能对已知突变位点进行检测，且不合用于融合基因。相比之下，NGS作为高通量的检测技术优势就显得非常明显；通过不停的优化，已经出现敏捷度达成万分之一的NGS检测试剂盒。并且NGS能够同时检测多个基因突变类型，涉及体细胞突变、基因扩增和融合，能够对突变丰度低到0.02%的基因进行检测，且特意性达成96%，因此非常适合对液体活检进行基因检测。第三，CTC和ctDNA的诊疗价值还需要更多的研究去验证。现在，CTC在临床上的使用还局限在术后或晚期病人计量外周血中CTCs的数量，预测预后，CTCs在早期患者中的研