第二十一章基因诊断与基因治疗

第二十一章基因诊疗与基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapy一、授课章节及重要内容：第二十一章基因诊疗与基因治疗二、授课对象：临床医学、防止、法医（五年制）、临床医学（七年制）三、授课学时本章教学共1学时。讲授安排以下：基因诊疗0.5学时，基因治疗0.5学时。四、教学目的与规定通过本章学习，从整体上理解基因诊疗和基因治疗的基本概念、基本理论。理解内源基因变异和外源基因入侵是造成人类致病的两大类因素。理解基因诊疗和基因治疗惯用技术办法的类型和基本知识，理解基因治疗的基本程序。五、重点与难点重点：掌握基因诊疗、基因治疗的概念和理论。难点：①限制性内切酶酶谱分析法原理。②DNA限制性片段长度多态性及其用于基因诊疗的原理。③PCR/单链构象多态性分析。④基因灭活的几个办法。⑤基因治疗的载体。六、教学办法及授课大致安排教学办法：重要是自学形式，讲授基因诊疗与基因治疗的概念。授课大致安排：前言3分钟，基因诊疗概念2分钟，诊疗办法15分钟；基因治疗概念2分钟，办法15分钟，基因治疗的基本程序8分钟。七、重要外文专业词汇genediagnosis,genetherapy,RFLP,SSCP,genechip,RNAi,triplexapproach八、思考题1.什么是基因诊疗？介绍基因诊疗的惯用技术办法。2.简朴介绍基因诊疗的应用。3.什么是基因治疗？简述基因治疗的办法。4.基因灭活的重要办法有哪些？简述灭活的原理。5.简述基因治疗的基本程序。九、教材与教具:人民卫生出版社《生物化学》第六版十、授课提纲(或基本内容)概述Introduction基因诊疗与基因治疗是分子生物学理论和技术应用到临床医学所产生的新的诊疗和治疗疾病的办法。这些新办法是现有诊疗和治疗疾病手段的补充和扩展。随着分子生物学理论和技术的新进展不停应用于临床医学研究，人们对疾病发生、发展的分子机理的认识也不停进一步；从基因水平诊疗疾病和治疗疾病已成为当代基础医学和临床医学研究的重要内容。随着科学研究的不停发展，基因诊疗和基因治疗将会为人类健康带来更大的福音，为人类根治疑难绝症带来但愿和曙光。下面分基因诊疗和基因治疗两个方面给大家介绍这一章的内容。第一节基因诊断SectionIGeneDiagnosis{基因诊疗}是指运用分子生物学技术和办法直接检测基因构造及其体现水平与否正常，从而对疾病作出诊疗的办法。从基因水平而言，造成人类致病的因素有两大类：①机体本身基因（即内源基因）的变异，涉及基因构造突变和基因体现异常。②病原体基因（即外源基因）的入侵。在分子生物学技术建立之前，我们无法直接鉴定基因的缺点，只能通过缺点基因所造成的表型症状或根据缺点基因引发的多个生化指标或其它辅助检查指标的变化对疾病作出诊疗。随着分子生物学技术的发展，现在我们能够采用分子生物学技术直接检测和鉴定与否有内源缺点基因或外源基因的存在，使疾病的诊疗在传统的表型诊疗基础上增加了基因诊疗的内容，从而使许多疾病的诊疗更快速、更精确。基因诊疗与传统诊疗学办法的不同之处在于它是直接以基因作为探核对象。因而，它含有与其它诊疗学办法完全不同的特点：①针对性强：由于基因诊疗是直接以基由于检测对象，对病因诊疗的针对性强。②特异性强：基因诊疗采用的分子生物学技术（核酸分子杂交、PCR等）都能精确地分析特定基因中的特定序列的构造、或特定基因的体现水平，因而含有很强的特异性。③敏捷度高：以往的诊疗需要满足一定量的样品，对微量样品根本无法进行操作或不敏感，无法作出诊疗。而分子杂交和PCR技术都能运用极少量的样品获得精确的成果，特别合用于疾病的早期诊疗。④合用范畴广：基因诊疗即可检测出内源性基因与否异常，也可检测出人体内与否有外源性基因的存在，因此，能够用于许多疾病的诊疗，在临床上合用范畴广。一、基因诊疗惯用技术办法：基因诊疗惯用技术办法涉及两大类：一是DNA诊疗技术；二是RNA诊疗技术。DNA诊疗技术涉及：核酸分子杂交技术、PCR技术和DNA序列测定等；RNA诊疗技术涉及：RNA点杂交、Northern分析、定量PCR、mRNA差别显示PCR等技术。在这一节只介绍DNA诊疗技术中几个惯用的办法。1．核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是基因诊疗中的基本技术之一。它的基本原理是：单链核酸（DNA或RNA）能够在一定条件下与互补的单链核酸（DNA或RNA）结合形成双链。杂交能够在DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA以及DNA-寡核苷酸之间进行。因此，采用一段已知的核酸序列作为探针，能够探测未知样品中对应的核酸序列与否存在，如果样品中有同源序列存在，核酸探针就能够与同源序列中的互补序列结合形成双链，从而得知特定核酸的存在与否。如用一段白血病有关基因的DNA序列制备成探针（已知），去探测被检样品（未知），如果被检样品中存在与探针序列相似的DNA序列，探针就可与之结合形成双链，检测成果可作为诊疗白血病的重要根据之一。运用核酸分子杂交技术能够进行限制性内切酶酶谱分析、DNA限制性长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RLFP)分析，在杂交中运用等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide，ASO)还能够分析特定基因中的突变位点。这里我们只介绍前两种。（1）限制性内切酶酶谱分析法：此办法是运用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测与否存在基因变异。图22-1所示为β珠蛋白的基因。当该基因第六个密码子发生A→T突变时，所编码的氨基酸从谷氨酸被变化为缬氨酸，因而造成镰状细胞贫血症。该突变同时也造成DNA序列中的一种MstⅡ限制性酶切位点丢失，运用这一特定可进行基因诊疗。将正常人和带有突变基因个体的基因组DNA分别用MstⅡ酶消化后，但凡基因组上含有MstⅡ位点的地方都会被切断，酶切后得到大小不等的片段。全部这些片段可通过电泳进行分离。在电泳过程中，各个片段可按大小分离开来。由于我们提取的是基因组DNA，在进行凝胶电泳时，每条带的量是极少的，电泳后的条带是完全看不见的。通过核酸分子杂交能够显示特定DNA片段。运用β珠蛋白基因的DNA探针可显示出该基因的DNA片段。在图21-1（见六版教材图21-1）中所示，β珠蛋白基因有MstⅡ位点，因此该基因的DNA序列被切断，杂交后显示出2个DNA片段（1.15Kb和0.2Kb）。当突变使MstⅡ位点丢失后，该基因的DNA片段不能被切断，因而在电泳及杂交后只显示1个大的DNA片段（1.35Kb）；如果是杂合子，杂交后就会显示3个DNA片段。因此，这种办法不仅能够诊疗出是正常人还是患者，并且还能够诊疗出是纯合突变还是杂合突变。图21-1镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析（2）DNA限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变，）中性突变造成个体间核苷酸序列的差别，称为DNA多态性。突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA次序发生变化。其中有些可能造成限制酶切位点的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位点数目、位置发生变化。用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，这就是限制性片段长度多态性。在某一特定家族中，如果某一致病基因与某一特异的多态性片段（DNA多态性或限制性片段长度多态性）紧密连锁，就能够用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭组员或胎儿与否为致病基因的携带者。用“遗传标志”基因作为探针，进行杂交检测就可判断致病基因的存在与否。2.PCR/单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)PCR/SSCP是一种快速检测基因突变的办法，其基本的原理是：单链DNA呈现复杂的构象，而这种立体构象重要是依靠单链内碱基配对等分子内互相作用维系的。相似长度的单链DNA因碱基序列不同，甚至只是一种碱基不同，都能够形成不同的空间构象，在电泳时泳动的速率不同。进行该项检测，首先是运用PCR技术看待测基因片段进行扩增，分别获得正常对照DNA的PCR产物和待测DNA的PCR产物，然后将DNA变性成单链，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中形成不同的构像。在电泳过程中，长度相似而构像不同的单链DNA分子在凝胶中的泳动速率不同。如果待测DNA没有发生突变，其序列与正常对照DNA一致，电泳后在凝胶中的位置就会与正常对照组DNA的每一条带的位置完全一致。如果待测DNA中有突变，电泳后就会出现位置不同的条带。借此分析与否有致病基因的存在。Leber遗传性神经病患者是由于线粒体DNA第11778位碱基（G→A）突变所致。用PCR办法获得正常和待测线粒体DNA片段后，再作SSCP分析（图21-2见六版教材图21-2），可见待测DNA的电泳后条带与正常DNA对照条带不一致，阐明该基因存在有突变。图21-2Leber病患者PCR/SSCP分析二、基因诊疗的应用现在基因诊疗已广泛应用于下列疾病的诊疗：如遗传疾病、肿瘤、多个感染性疾病、传染性流行病以及用于判断个体疾病易感性、器官移植组织配型、法医学中个体识别、亲子鉴定等。由于基因诊疗含有其它诊疗学办法所不含有的特点，它将在遗传病的防治、肿瘤的早期诊疗、暴发性感染性疾病的预测等方面将发挥越来越大的作用。第二节基因治疗GeneTherapy现在已知许多人类疾病与特定的某个基因或某些基因有关，经常涉及到人体内基因的变异或基因体现的异常以及外源基因的入侵。因此，从基因水平消除病因将成为将来医学的一种重要发展方向。一、基因治疗的定义基因治疗在早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗办法。随着分子生物学办法和技术的不停发展和完善，基因治疗的内涵已有了很大的发展。从广义上来讲，基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达成治疗疾病目的的一种治疗办法。基因治疗采用办法基本上能够分为下列几个：1.基因矫正（genecorrection）基因矫正是指将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保存。2.基因置换（genereplacement）基因置换是用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替代病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。基因置换是基因治疗的一种最为抱负的办法。但由于这种办法需要采用同源重组使对应的正常基因定位导入受体细胞的基因缺点部位。而定位导入的自然发生率约为1/100万，因此，由于技术因素，这种治疗办法现在还难以实施。3.基因增补（geneaugmentation）基因增补是基因治疗中较惯用的一种办法。它是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的定点或非定点整合，使其体现产物赔偿缺点基因的功效或使原有的功效得以加强。基因增补实际是在原有细胞中又增加了一种基因的拷贝，即使异常基因还存在于细胞内，但该基因编码的产物是无毒性作用的，只是编码产物的量局限性、或失去功效而造成疾病。因此，导入一种正常的基因使其体现产物赔偿缺点基因的功效或使原有的功效得以加强，达成治疗疾病的目的。4.基因失活（geneinactivation）基因失活是采用特定的方式克制某个基因的体现，或者通过破坏某个基因而使之不能体现，以达成治疗疾病的目的。与基因增补不同，基因失活是由于基因编码的产物是有毒的，即使体现得量极少也会致病，如癌基因、病毒癌基因等，这些基因编码的产物都是有致病作用的。因此必须采用特定的方式克制或破坏这些基因的体现，使基因失活，以达成治疗多个癌症和病毒性感染性疾病的目的。①反义RNA技术：是指与mRNA互补，且能克制与疾病发生直接有关的基因体现的RNA。②核酶技术（ribozyme)：通过核酶分子结合到靶RNA分子中适宜的部位，形成锤头构造，催化RNA分子的剪切，从而破坏靶RNA分子达成治疗疾病的目的。③三链技术(triplexapproach):脱氧寡核苷酸能与双链DNA专一性序列结合，形成三链DNA，从而在转录水平或复制水平制止基因转录或复制。④干扰RNA技术（interenceRNA，RNAi）：指在特定因子的作用下，由导入胞内的双链RNA降解成的约22nt左右的SiRNAs。后肢运用碱基互补配对原则核靶DNA结合，同时诱导激活体内的基因沉默因子，从而使靶DNA降解。同时还可运用体内转录系统转录生成第二代SiRNAs，从而长久发挥效应。二、基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序涉及有下列几个方面：（一）治疗性基因的选择基因治疗中，必须针对某一具体的疾病，来选择目的基因。如单基因缺点的遗传病可选用对应的野生型基因作为目的基因。血管栓塞性疾病可选用血管内皮生长因子（VEGF）基因作为目的基因。在多个癌症和病毒感染性疾病治疗中，可针对特定的靶基因选用特异的反义RNA、核酶等的编码DNA作为治疗基因。选择特定的目的基因作为治疗基因是基因治疗中一种重要的问题。（二）基因载体的选择选择好目的基因后，还必须选择适宜的载体。目的基因只有重组到适宜的载体、形成重组DNA分子，才干导入到受体细胞中。用于基因治疗的载体有两大类：一是病毒载体，二是非病毒载体。非病毒载体转染效率很低，而病毒含有繁殖快，感染力强的生物学特点，因而用于基因治疗的载体普通多选用经改造后的病毒载体。惯用的病毒载体有3种：逆转录病毒（retrovirus,RV）载体、腺病毒（adenovirus,AV）载体、腺有关病毒（adenoassociatedvirus,AAV）载体。3种病毒载体各有优缺点。表22-1（见五版教材表22-1）列出了它们各自的特点。3种病毒载体中使用较多的是逆转录病毒载体。该载体用于基因治疗含有转移基因效率高和稳定体现的特点。但是，它只能感染处在增殖状态的细胞，使用范畴较局限。另外，逆转录病毒载体在靶细胞基因组的整合是随机的，有可能会激活原癌基因，其安全性仍然是一种值得担忧的问题。但由于病毒载体介导基因转移的效率较高，且迄今为止尚未出现明显的问题，现阶段用于基因治疗的载体仍多采用病毒载体，随着科学研究的不停进一步，相信会有更抱负的载体来替代病毒载体用于基因治疗。表22-1几个惯用病毒载体的特点比较（三）靶细胞的选择目的基因与载体构建成重组的DNA分子后，需要导入适宜的靶细胞才干发挥治疗作用。对不同的疾病，需要选择不同的靶细胞。普通而言，可供选择的靶细胞有两大类：一类是生殖细胞，一类是体细胞。对人类基因治疗研究而言，为了避免给人类造成可能的伤害，国际上严禁进行生殖细胞的基因治疗操作。在现在条件下，基因治疗仅限于体细胞。由于即使发生基因型的变化也只限于某一类体细胞，其影响也只限于某个体的当代。已被用于基因治疗的靶细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌细胞和肿瘤细胞等。（四）基因转移通过上述环节，构建好了重组DNA分子，也选择好了靶细胞。下一种核心环节将治疗性基因导入靶细胞。现在惯用的基因载体有两大类，因而基因转移办法亦对应有两大类。非病毒载体重要通过非生物学办法导入靶细胞，这类基因转移办法涉及物理、化学、以及受体介导的办法；但这些办法转移基因的效率较低。病毒载体重要通过生物学办法导入靶细胞，即运用病毒蛋白将载体包装成假病毒颗粒，通过病毒感染机制将基因载体导入靶细胞。病毒载体的转染效率相对较高，因而在基因治疗的临床实施中多采用病毒介导的基因转移技术将外源基因导入靶细胞中。然而在实际应用中，即使是采用病毒载体也不能有效地进行体内基因转移。由于众多因素的影响，现在在体内很难实现靶向、高效地转移治疗性基因体现载体。这个问题是制约基因治疗技术发展的瓶颈问题。（五）外源基因体现的筛检由于体内转染困难，在基因治疗研究中，大多数状况下是将基因导入体外培养的细胞。无论采用上述哪种办法将外源基因转移到体外培养的靶细胞中，转移后的产物实际是混合物。在混合物中有的细胞含有特异的外源基因，这类细胞称为转化细胞。有的细胞不含外源基因，这类细胞称为非转化细胞。基因治疗中需要的是含有特异外源基因的转化细胞。因此，必须筛选出转化细胞。筛选是运用载体分子上携带特定抗性基因进行的。在大多数哺乳动物细胞体现载体上都带有新霉素抗性基因(neor),该基因编码的产物是一