加德纳菌感染对大鼠睾丸生精小管的影响

加德纳菌感染对大鼠睾丸生精小管的影响

加德纳感染（gv）是女性细菌阴道感染的主要病原体之一，可以通过性接触传播。近年来,国内外研究发现,不明原因的男性不育患者精液中Gv的检出率明显高于正常男性,提示Gv感染与不育可能有密切关系,张水林等报道Gv感染在男性不育的发生、精子质量的改变中可能起一定的作用。但Gv感染引起不育的病理机制尚未阐明。睾丸生精细胞凋亡是生精过程中发生的一种正常生理现象,这对于清除受损生精细胞、控制其数量具有重要意义。生精细胞大量凋亡,则会导致生精障碍。电镜是观察细胞凋亡最可靠的方法,凋亡细胞在透射电镜下其形态学改变具有特征性。现已证明,支原体感染的SD雄性大鼠睾丸严重损伤,并引发不育,而Gv感染常常伴随支原体感染。本实验建立Gv感染的动物模型,采用HE染色光镜结合电镜观察,检测模型动物睾丸生精小管的变化,采用流式细胞术检测生精细胞凋亡情况,旨在为阐明Gv感染影响精子生成,导致不育的致病机制提供实验依据。1材料和方法1.1大鼠中科院动物所选用体重180~220g,出生60~70d的清洁级,雄性SD大鼠(中科院动物所)18只,随机分为对照组6只和实验组12只。1.2实验大鼠睾丸脱服务在传统知识体系中的表达无菌实验条件下,戊巴比妥钠(35mg/mL,1.8mL/kg)腹腔注射,麻醉动物后,打开腹腔,充分暴露膀胱,将膀胱内尿液抽出,采用1mL注射器,实验组膀胱内注射1mLGv菌液(上海同济医院叶元康老师赠送,梅里埃比浊管测定,108/mL),对照组膀胱内注射相应的无菌液体培养基1mL,每只注射一次,手术完毕缝合关腹,并且在同一无菌条件下饲养21d后颈椎脱臼处死大鼠。1.3细菌培养和鉴定随机取每鼠的部分睾丸组织,接种于Gv选择性培养基上,置于5%CO2、37℃孵育箱孵育24~48h,观察菌落周围溶血环,刮取细菌,马尿酸试验鉴定细菌,涂片革兰染色,油镜下查找Gv,电镜下观察细菌形态,以鉴定模型是否成功建立。1.4多聚赖氨酸载玻片的制备迅速摘取睾丸,取每只鼠的部分睾丸组织立即置于Bouin′s液中固定,12h后系列酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚5μm,贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上,54℃烤干2h备用。1.5生精细胞的观察将待用的组织切片经二甲苯脱蜡,系列酒精下行入水,苏木精染细胞核,盐酸酒精分色后,用伊红染细胞质,蒸馏水短洗后,经系列酒精脱水,二甲苯透明、封片,光镜(NikonE600,日本)下观察生精上皮的细胞层次、形态结构、脱落及凋亡的生精细胞。1.6结构观察和电镜观察取部分睾丸组织立即置于2%戊二醛固定,环氧树脂Epon812包埋,超薄切片(厚度100nm),电镜(Phllip-CM120TEM,荷兰)观察。1.7细胞凋亡检测单细胞悬液制备按文献方法略加修改,取部分睾丸组织,剪碎,120目网孔轻压过滤,离心。0.25%胰蛋白酶消化,37℃水浴4min,300目网孔过滤PBS洗,300×g离心5min,70%酒精固定过夜,离心去酒精,加入2mLPBS放置10min,离心,取(1~2)×106个细胞加入RNA酶,然后再加入PI(25μg/mL,Sigma,美国)染液,常温下染色15min,上机检测(FACsCealibur,美国BD公司),对细胞群用荧光通道2(FL2W/FL2A)宽度和面积进行开商,去除细胞碎片团块,对完整的细胞进行分析,正常细胞周期峰前面出现的亚峰即为凋亡峰(apoptosispeak),另取部分睾丸组织,制备成单细胞悬液,用Annexin-Ⅴ与PI染色,上机检测凋亡细胞百分率。2结果2.1睾丸生精细胞排列能力的测定睾丸组织经选择性培养基培养后,对照组均未见菌落出现,马尿酸实验无色,呈阴性。实验组动物12只中11只有菌落出现,菌落周围出现β-溶血环,马尿酸实验紫色,呈阳性,光镜下细菌呈革兰阴性链状短杆菌,电镜下细菌呈链状连接,电子密度不等(图1~3)。由此说明实验组动物12只中,11只建模成功,成功率达91.7%。光镜下显示,对照组睾丸生精小管规则,界膜完整,各级生精细胞排列有序(图4A)。实验组凋亡生精细胞明显多于对照组,可见大量不同时期凋亡形态的生精细胞,细胞皱缩、胞膜完整,染色质边聚,呈新月状或沙丘状,高倍镜下典型凋亡形态细胞的核膜较清晰(图4B、C),部分生精小管凋亡严重,呈广泛的生精小管退行性变化,包括生精小管萎缩和生精细胞严重脱落,有的生精小管仅剩下少量精原细胞和支持细胞,部分生精小管支持细胞也明显减少,生精小管中出现大量的多核巨细胞,位置靠近生精小管的管腔,细胞体巨大,可有数个至数十个核,核密度不均匀,部分高度浓缩,呈致密核(图4D)。2.3精细胞凋亡和变性收缩对照组大鼠睾丸生精细胞及支持细胞染色质均匀,核膜完整平滑,细胞器结构正常(图5A、B)。实验组大鼠睾丸生精细胞出现大量不同时期凋亡现象,染色质浓缩,多数附于核膜,附着区核孔消失,部分核发生碎裂(图5C);支持细胞变性收缩,细胞间出现大的间隙,细胞膜不规则,细胞质内出现大量的空泡和髓样结构,脂滴明显增大,细胞核收缩,核膜不规则(图5D)。生精小管管腔生精细胞排列紊乱(生精小管底部可见蝌蚪状精子)(图5E)。2.4实验组单倍体峰前出现亚峰经检测,对照组可见3个正常峰,峰1为单倍体峰,峰2为二倍体细胞峰,峰3为四倍体细胞峰。各峰前未出现AP峰(图6A),实验组单倍体峰前出现亚峰,即AP峰(图6B)。采用SPSS10.0统计软件对各组的凋亡细胞(含各级精母细胞、支持细胞等)百分率进行t检验统计分析,对照组与实验组凋亡细胞百分率分别为(9.59±2.2)%,(23.23±7.4)%,差异有统计学意义(t=3.13,P<0.05)。3gv感染导致睾丸生精细胞凋亡近年来,有关Gv引起男性不育的报道逐渐增多,男性不育往往是由多种不同因素造成的一个共同的病理结果,因而探讨男性不育的发病机制一直是男性生殖病理研究的重点内容。细胞凋亡是多细胞有机体为了调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程。人体在正常生精过程中也存在着少量生精细胞凋亡,这对睾丸的许多正常生理功能具有重要的意义。有研究表明,在生理情况下,睾丸生殖细胞中的细胞凋亡主要见于精原细胞和精母细胞,很少发生在精子细胞中。但若生精细胞的凋亡超过了正常范围,可能导致不育。本研究通过建立Gv感染的SD大鼠模型,观察到Gv感染后生精细胞发生凋亡、脱落,支持细胞变性,出现大量多核巨细胞,经过流式细胞术检测,单倍体细胞峰前出现凋亡峰,证实了Gv感染导致超过生理数量的生精细胞凋亡,从而影响精子的发生。Gv感染引起不育的可能原因有:(1)Gv产生的外毒素直接作用于各级生精细胞导致细胞出现大量凋亡、脱落,影响精子的形成,使成熟精子数量减少;若损伤严重,则可表现为少精症或无精子症,从而导致生殖能力下降,以致不育。(2)Gv产生的外毒素导致支持细胞变性,胞质塌陷,从而破坏了支持细胞对生精细胞的支持、营养功能,致使生精细胞向管腔面的移动及释放精子的功能异常,从而使生精细胞排列紊乱,并使镶嵌其上的生精细胞因无所附着而致