啤酒废酵母菌中谷胱甘肽的提取

啤酒废酵母菌中谷胱甘肽的提取

谷冈甘醇是含有l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸的三醇化合物。它是由含有糊精的生物活性三醇化合物（gsh）和氧化（gssg）组成的。GSH在生物体内具有多种重要的生理功能,特别是对维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用,在食品、医药、保健品、化妆品工业中均有广泛的应用价值。GSH的制备方法包括化学合成法、酶法和发酵法,其中发酵法是最具潜力的方法;制备来源以酵母为主。由于GSH存在于细胞内,所以要得到GSH,首先必须采用一定的破壁手段,使GSH溶出。目前关于酵母破壁的研究较多,大体可归纳为:化学破壁(酸解、碱解)、物理破壁(液体剪切、固体剪切等)、生物破壁(酶解、自溶)。但是目前的方法尚存在一些问题。如GSH不稳定,无法满足食品、医药等领域所要求的产品纯度高,采用溶剂无毒等。对羟基苯甲酸酯是国际上公认的安全、高效、广谱性食品防腐剂,其抗菌机理是破坏微生物的细胞膜,导致细胞自溶而发挥抑菌作用。本研究利用质优价廉的啤酒废酵母资源,以对羟基苯甲酸酯作为酵母菌细胞壁破壁剂;用它从啤酒废酵母细胞中提取还原型谷胱甘肽的方法目前未见文献报道。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验材料啤酒酵母泥:由华润集团武汉东西湖啤酒公司提供。1.1.2材料、试剂和仪器DTNB、98%GSH:Sigma,武汉新锐生物分装;Tris生化试剂:Amresco,武汉新锐生物分装;对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯:分析纯,天津市科密欧化学试剂开发中心;其余试剂均为国产分析纯。1.1.3中国南京实验设备超声波细胞粉碎机JY92-Ⅱ,宁波新芝生物科技股份有限公司;显微镜XSP-18A,中国南京实验设备制造厂;超级恒温器CS501型,重庆试验设备厂;722可见分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;AB104-N电子分析天平,Mettler-ToledoInstr.(Shanghai)Ltd。1.2测试方法1.2.1啤酒酵母树制备啤酒废酵母包括过筛、除杂,以得到纯净的啤酒废酵母。其工艺流程如下:啤酒废酵母→无菌水稀释→80目筛子筛分二次→100目筛子筛分二次→离心分离→纯净的啤酒酵母。1.2.2破壁前后母细胞的计数采用血球计数板法。1.2.3gsh含量测定将分析样品1mL加入3mL0.15mol/LNaOH溶液中,摇匀,此时溶液pH≥12,再加入φ=0.03甲醛1mL,摇匀,静置2min,立即取1mL加入到5mLDTNB分析溶液(0.01mol/LDTNB溶液由0.05mol/LpH7的磷酸缓冲液配制后按1:100体积比与0.5mol/LpH8Tris-HCl缓冲液配制而成,现用现配)中,摇匀,在25℃水浴中静置5min后,测定在波长412nm处的吸光度A值,将该吸光度A值乘以1.02,根据建立的标准曲线计算测定样品中GSH的含量。1.2.4啤酒酵母干酵母泥的提取对羟基苯甲酸酯处理方法:取啤酒酵母干酵母泥10g,按1∶2(W/V)比例加入20mL破壁溶液,合适温度下搅拌破壁,定时取1mL样离心,测定上清液GSH含量,计算破壁率。超声波法抽提:间隔2s,工作时间1s,全程时间40min,温度30℃,输出功率400W;变温法抽提:取啤酒酵母干酵母泥10g,将其制成悬浮液,调好pH值后冷冻结冰,在95℃下迅速融化,保温一定时间,反复进行2次;自溶法一抽提:取啤酒酵母干酵母泥10g,将其制成悬浮液,调好pH值后加入一定量的NaCl,温度55℃,时间48h;离心后上清液加热至80℃,维持15min;自溶法二抽提:取啤酒酵母干酵母泥10g,将其制成悬浮液,调好pH值后加入一定量的硫胺素和葡萄糖,25℃水浴30min,再升温57℃保持8h。离心,测定上清液GSH含量,计算破壁率。2结果与分析2.1关于乌拉苯甲酸的法2.1.1对羟基苯甲酸乙酯和丙酯破壁效果曲线图1中系列3、系列4分别为0.5%和1.0%的对羟基苯甲酸甲酯破壁效果曲线;系列5、系列6分别为0.5%和1.0%的对羟基苯甲酸乙酯破壁效果曲线;系列7、系列8分别为0.5%和1.0%的对羟基苯甲酸丙酯破壁效果曲线。从图中可以看出,对羟基苯甲酸酯的使用浓度只需要0.5%即可,且对羟基苯甲酸丙酯的破壁效果优于对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸甲酯的效果。破壁最佳时间均为3h。2.1.2菌体与破壁液对羟基苯甲酸丙酯破壁效果分析破壁缓冲液的多少对破壁有很大的影响。若过多,则谷胱甘肽易被氧化;若过少,则破壁效率过低。为此,我们按不同比例将菌体与破壁液进行混合破壁,结果见图2。图2中系列3为破壁液与菌体比例1.0∶2.0的对羟基苯甲酸丙酯破壁效果曲线;系列4为破壁液与菌体比例1.0∶1.0的对羟基苯甲酸丙酯破壁效果曲线;系列5为破壁液与菌体比例1.0∶3.0的对羟基苯甲酸丙酯破壁效果曲线。2.1.3在不同温度下gsh的稳定性各取50mL标准GSH溶液(50mg/100mL)在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下保温1w(定时补充水分),取出定容至50mL,分别测定各种温度下GSH的含量,其结果见图3。由图3可看出,当温度超过40℃后GSH的稳定性急剧下降,可见温度对GSH的稳定性影响较大;破壁最高温度应低于40℃。2.1.4gsh含量测定各取50mL标准GSH溶液(50mg/100mL)分别调成pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9八种不同的pH值,将各种pH的GSH溶液于室温下放置5w,分别测定各种pH条件下溶液中GSH的含量,其结果见图4。从图4可知,当GSH存在的环境pH为5.0-6.0时,GSH损失率最低。2.2gsh提取率较低试验中对各种提取方法进行了比较(表1)。通过比较可以看到,几种方法都可以提取啤酒废酵母细胞中的GSH。超声波法破壁较完全,加入SiO2粉末后破壁率和GSH含量要明显高于未加入SiO2粉末时的情况,其原因在于SiO2粉末在破壁过程中起到了增大其与啤酒酵母细胞之间的摩擦,加大了破壁力度。虽然其破壁率最高,GSH提取率却明显低于对羟基苯甲酸酯法的GSH提取率。变温法的GSH提取率是这几种方法最低的,其原因可能是反复冻结使得GSH损失严重。自溶法虽然条件较温和,但是GSH提取率和破壁率均明显低于对羟基苯甲酸酯法的GSH提取率和破壁率,其原因在于自溶法的破壁温度为55-57℃,而当温度超过40℃后GSH的稳定性急剧下降(见图3)从而导致GSH提取率较低。对羟基苯甲酸酯法在较短的时间内,达到较高的GSH提取水平。GSH为小分子物质且在水中的溶解度很大,在细胞不完全破碎的条件下,只要细胞表面产生一些裂缝,GSH就可以顺利地扩散到溶剂中,所以利用一些条件相对温和的方法在提取GSH等小分子物质方面是可行的。3样品含量的测定3.1.1试验结果表明:对羟基苯甲酸酯法抽提啤酒废酵母菌细胞中的谷胱甘肽(GSH),最佳抽提条件为:按菌体与破壁液比例1∶2(W/V)加入0.5%的对羟基苯甲酸丙酯,30℃,pH5-pH6,搅拌3h。在最适抽提条件下,谷胱甘肽(GSH)在破壁离心后上清液中平均含量可达96.71mg/100mL,平均破壁率66.80%;说明此方法是可行的。3.1.2对羟基苯甲酸酯是食品及药品制造