生物制药工程设备【4】细胞生物反应器2

《生物制药工程设备》细胞生物反应器细胞生物反应器CotterBrothersCo.(美国)提纲第一节发酵罐第二节动物细胞生物反应器第三节植物细胞生物反应器第四节细胞生物反应器的搅拌功率第五节细胞生物反应器中氧的传递第六节细胞生物反应器的放大第七节圆筒体和搅拌轴强度的计算预制一次性生物反应器第二节动物细胞生物反应器通用的微生物发酵罐不适用于动物细胞的大量培养，需要针对其特点和培养要求设计新型的细胞生物反应器通过动物细胞的大规模培养，可以得到疫苗、诊断试剂、单克隆抗体、酶等贵重药品和生物制品。动物细胞没有细胞壁，比较脆弱，对剪切作用十分敏感，甚至承受不了通气鼓泡造成的剪切作用。动物细胞对培养基的营养要求苛刻，对环境条件的变化也相当敏感。动物细胞培养难度大，多数设备结构复杂，一般生产规模比较小。因此，设备容积相比微生物发酵要小得多。一、气升式细胞培养生物反应器开发于1956年。目前已广泛地应用于动物细胞培养。最初用于大型化生产单细胞蛋白，后来发现可用于动植物细胞培养。杂交瘤细胞可在气升式反应器中培养，也可以在搅拌槽式反应器中培养。一、气升式细胞培养生物反应器一般采用内循环式，有时也采用外循环式。一、气升式细胞培养生物反应器一、气升式细胞培养生物反应器一、气升式细胞培养生物反应器Air-liftbioreactorbeingraisedintopositionattheICI,Ltd.factory,Billingham,UK一、气升式细胞培养生物反应器(一)反应器的操作规模从5L到10000L。逐级放大的主要问题是控制通气速率和混合性能，以保证细胞、溶解氧和培养物质的均匀分布。培养工艺是采用阶段式系统，如：先在10L反应器中培养2-3天，再逐级转移到100L和1000L或更大的反应器。阶段式培养系统的优点：细胞优化生长，从10L到1000L培养，共需17天，可生产单克隆抗体100g。(一)反应器的操作空气进入采用环形管气体喷射器，孔的设计要保证在规定的空气流量下使气泡直径达到要求的范围之内。空气流量一般控制在0.01-0.06vvm，反应器的高径比一般为3-12。(二)无菌控制材料：不锈钢材质管道：尽量采用焊接，必要时可配备密封性能好的阀门和泵。灭菌：就地清洗(CIP)，就地灭菌(SIP)。气体：除菌后喷入反应器；一定要经过处理后再通过过滤器排放。培养基：过滤除菌。只要严格遵守操作规程，就可保证过程无菌(三)过程控制及自动化溶氧：自动调节进入空气、纯氧、氮气的流量pH：在空气中加入二氧化碳或在培养基中加入氢氧化钠温度：夹套循环水消泡：一般不会产生泡沫，如果需要可采用特定的消沫剂进行控制细胞生长：无菌取样离线计数或通过氧的消耗量进行间接测定通过过程优化后，气升式反应器显著优于传统的反应器(三)过程控制及自动化动物细胞培养，一般首选气升式反应器二、中空纤维管生物反应器膜反应器的一种，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度可高达109/ml。二、中空纤维管生物反应器中空纤维管生物反应器由多根中空纤维管组成，中空纤维管是半透性多孔膜，内径为200μm，壁厚为50-75μm。氧与二氧化碳可以自由透过膜双向扩散，而大分子的有机物则不能透过。动物细胞贴附在中空纤维管的外壁生长。生长表面积与容积之比可达40多倍。溶氧传递速率比悬浮培养高三倍。缺点：灭菌困难，一旦污染，将导致整个装置报废。二、中空纤维管生物反应器HollowfiberBioreactor二、中空纤维管生物反应器Crosssectionofahollowfibercartridge.二、中空纤维管生物反应器Biovest’shollowfiberbioreactors

二、中空纤维管生物反应器Crosssectionofahollowfibercartridge.二、中空纤维管生物反应器Cross-sectionofahollowfiberbioreactorshowingthefibersandlymphocytesinsuspensiongrowingaroundthefibers.二、中空纤维管生物反应器Scanningelectronmicroscope(SEM)imageofvascularsmoothmusclegrowingontheoutsideofthefiber;bovineaorticendothelialcellsareontheinsideofthefiber.二、中空纤维管生物反应器二、中空纤维管生物反应器AutovaxIDhollow-fiberbioreactor二、中空纤维管生物反应器二、中空纤维管生物反应器Hollowfiber二、中空纤维管生物反应器FiberCellSystemsHollowfiberBioreactor二、中空纤维管生物反应器FiberCellSystemsHollowfiberBioreactor二、中空纤维管生物反应器McGowanHollowfiberBioreactor三、通气搅拌生物反应器动物细胞培养的通气搅拌生物反应器要求剪切力小且混合性能好。三、通气搅拌生物反应器(3-5个)转速<50rpm载体不能进入气腔气泡不与细胞直接接触旋转鼓泡四、流化床生物反应器原理：支持细胞生长的微粒呈流化状态。微粒的直径为500μm左右，具有多孔性，可由胶原制备，再用无毒性的物质增加密度至1600kg/m3或更高，使其能在向上流动的培养液中呈流态化。细胞接种于微粒之中，通过反应器内向上循环流动的培养液使之成为流化床，并不断供给必要的营养，使细胞得以生长。同时，新鲜培养基不断加入，培养产物或代谢产物不断排出。四、流化床生物反应器反应器应满足以下要求：(1)细胞密度高(2)高产细胞长时间停留在反应器中(3)优化细胞生长与产物合成的环境四、流化床生物反应器流化床反应器既可以培养贴壁依赖性细胞，也可培养非贴壁依赖性细胞，可以达到较高的细胞密度。五、细胞培养灌注系统高密度培养动物细胞需要及时补给营养和排除有毒的代谢产物。分批培养通过部分换液实现营养的补给和有毒代谢物的排除。缺点是当细胞浓度达到一定量时，废代谢物的浓度可能在换液前已达到抑制浓度。连续灌注可解决以上问题。五、细胞培养灌注系统分批培养中，细胞密度为2×106~4×106个/ml，灌注系统中可达2×107~5×107个/ml。五、细胞培养灌注系统五、细胞培养灌注系统

PerfusionBioreactorSideviewoftheperfusionchamber;Topdownviewoftheperfusionchamber;Representationofthebioreactorsetupwithperistalticpumpandmediareservoirattached.六、一次性生物反应器使用由三层塑料膜组成的一次性塑料袋替代培养管或培养罐。第一层：一般为聚对苯二甲酸乙酯(PET)或低密度聚乙烯(LDPE)，以提供机械稳定性。第二层：使用的聚乙酸乙烯酯(PVA)或聚氯乙烯(PVC)制成，提供阻气性。第三层：即接触层，由PVA或聚丙烯(PP)制成。六、一次性生物反应器一次性生物反应器的搅拌与传统生物反应器类似，但其搅拌器是预先灭菌并整合在塑料袋之中的，通过机械或磁力与驱动器连接。也有的一次性生物反应器通过振荡实现搅拌作用。一次性生物反应器的参数测量较困难。pH主要通过含有pH敏感的微量pH包进行检测。优点：操作简单，减少清洗和灭菌的步骤，降低染菌风险，降低成本(超过60%)缺点：氧的传输较差，参数控制困难六、一次性生物反应器WAVE生物反应器六、一次性生物反应器WAVE生物反应器六、一次性生物反应器六、一次性生物反应器七、动物细胞对剪切作用的敏感性动物细胞生物反应器与常规反应器的主要区别：要求在温和地通气和缓慢的搅拌条件下保证较高的溶氧水平。此外，大部分动物细胞为贴壁生长细胞，更容易受到湍流带来的剪切作用和机械碰撞造成的破坏。在大规模动物细胞培养中，剪切力主要来自深层通气气泡的破碎、机械搅拌引起的漩涡和机械剪力等。(一)气泡对细胞的损伤一个气泡内部的压力可用下式表示：在普通发酵罐内气泡平均直径约为10-4m，则其半径为5×10-5m，代入上式，有p=1.42KPa，若气泡半径为10-5m时，则压力会更大。气泡的破裂相当于“爆炸”，其剪切力对细胞的杀伤力很大。(一)气泡对细胞的损伤在动物细胞培养过程中，加入较高浓度的血清和特定的非离子型表面活性剂可防止或减少气泡破碎造成的剪切作用。原理是加入的血清和表面活性剂可在液相界面上形成了一层高度稠密的界面结构，起到了保护细胞的作用。在设计无泡通气结构的反应器时，一般采用聚丙烯或硅橡胶为原料制成的多孔管作为通气材料，可以有效地克服因气泡破碎而引起的剪切损伤。(二)机械搅拌和湍流漩涡对细胞的损伤氧传递效果的好坏直接关系到反应器的生产能力。采用机械搅拌加强液相的湍流可以提高氧的传递，而液相湍流和桨叶带来的剪切力大小及其对培养的影响非常重要。在微载体培养中，当桨叶产生剪切力增加到一定的程度时，生长速度会突然下降。容易对细胞造成伤害的还有液相中的某些小的湍流漩涡，其大小及速度都会影响细胞的生长。此外，湍流中微载体之间的碰撞、微载体与反应器内静止部件的相互碰撞产生的剪切力同样会对细胞产生损伤。(三)剪切力的估算对细胞产生损伤的临界剪切力为：τcr=5Pa以昆虫细胞在气升式反应器中培养为例，其最大剪切力可用下式计算：若取液体密度ρL=1000kg/m3，阻力系数取最高值Kw=1.3，则可得出最大允许流体流速接近w。(三)剪切力的估算在气升式反应器中，气泡的喷射、上升和破碎是产生剪切力的三个主要因素，其剪切力可根据牛顿黏性定律进行估算：在培养液中，一般有类似甲基纤维素一类的物质时，其最大黏度可达μ=50×10-3Pa·s，假设细胞一边流体的速度等于临近气泡的速度，另一边的速度为零，气泡的速度取喷射口处的速度wi，其值可用下式近似求得：(三)剪切力的估算取每个孔的气体流量V=10-3m3/h，di=1mm，则可求出ωi。ωi=(三)剪切力的估算dx取细胞直径18μm，μ=50×10-3Pa·s。即可计算得到喷嘴处的剪切力：将计算得到的wi代入下式：τ=(三)剪切力的估算气泡上升的速度大致为0.25m/s左右，由此可计算得到气泡上升的剪切力为700Pa，比临界值仍然高出很多。气泡在液体表面下，由于液膜的表面张力作用会使液膜破碎，液体返回到液相主体时，必然伴随一定流体速度的产生。若取该速度为1.3m/s，此速度不算大，但产生的气泡破碎剪切力可高达3.7KPa，是产生剪切力三个主要因素中的最大值。(三)剪切力的估算通过上面的计算结果可以看出，在通气的条件下培养细胞，产生的剪切力远远超过细胞所能承受的临界剪切力。在实际通气时，高的剪切力只能再瞬间对细胞起作用。由于细胞本身的伸缩性很大，足以在一定范围内忍受大多数短时间的剪切。由此也可得出细胞膜表面张力小有助于提高细胞形状的伸缩性