窖泥微生物特性及其培养

窖泥微生物特性及其培养Characteristicsandculturingmethodsofmicrobesincellarmud李啸2013年5月28日1/56内容一、关于窖泥二、窖泥中的微生物三、窖泥中微生物代谢四、主要功能菌群分布及化学生态环境五、人工窖泥的培养六、窖泥培养中常用的酵母浸出物七、酵母浸出物在种子扩培中的应用1/56一、关于窖泥窖泥（Cellarmud

）：—“微生物黄金”。2005年4月26日开始的中华世纪坛“世纪国宝展”,在第一号展柜上，一块灰褐色泥巴与秦始皇陵的划船陶俑、中国最早的人造铁器等文物一起，戴上国宝桂冠--来自五粮液古窖池，至今已有637年的历史。窖泥中有机酸比例（己酸＞乙酸＞丁酸）是衡量窖泥是否优质的关键；防止窖泥中乳酸积累,减缓乳酸亚铁及乳酸钙的产生，防止窖泥老化；浓香型大曲酒的主体香是己酸乙酯。1/56二、窖泥中的微生物丁酸菌己酸菌甲烷菌硝酸盐还原菌醋酸菌乳酸菌硫酸盐还原菌窖泥微生物酵母菌1/56二、窖泥中的微生物

（1）呼吸作用呼吸是指在生物体中进行氧化作用的化学反应过程中，最终把氢传递给分子氧形成水或传递给其它氧化型化合物的过程。呼吸可产生较多的能量。如果氢传递给分子氧就叫做有氧呼吸，传递给其它氧化型化合物，例如硝酸盐、硫酸盐、碳酸盐等，则称之为无氧呼吸。

进行无氧呼吸的是厌氧微生物和兼性厌氧微生物。根据接受传递来的氢的化合物的不同，可分为硫酸盐呼吸、硝酸盐呼吸和碳酸盐呼吸等。1/56甲烷菌：严格厌氧菌，唯有厌氧滚管技术能够保证从头至尾隔绝氧气，不管厌氧袋、厌氧箱、还是厌氧罐，都不可避免会在接种或者存取过程中接触一定量的氧气，这对于“严格厌氧”微生物来说就是致命的。甲烷菌能源和碳源物质主要有5种，即H2/CO2、甲烷、甲醇、乙酸和乙胺。硫酸盐还原菌（sulfate-reducingbacteria，SRB）：严格厌氧菌，是一类能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、单硫还原为硫化物的微生物。硫酸盐呼吸是自然界中硫素循环中一个不可缺少的环节，当然，硫酸盐还原形成的主要产物之一硫化氢，不仅会污染大气和水环境，而且还会造成埋藏的金属管道与建筑构件的腐蚀。二、窖泥中的微生物

（2）严格厌氧菌（strictanaerobicbacteria）1/56丁酸菌：又称酪酸梭菌，丁酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium

butyricum）。丁酸梭状芽孢杆菌属于严格厌氧菌。将乙醇和乙酸合成丁酸，即先有丁酸发酵。二、窖泥中的微生物

（2）严格厌氧菌（strictanaerobicbacteria）1/56己酸菌：该菌系对厌氧条件的要求并不严格，属于耐氧性厌氧细。菌，在一般条件下液体深层培养就能满足其生长，空气系数对芽孢和产酸的影响较小，适合于工业化生产。己酸菌将乙醇及丁酸转化为己酸时,必须先有丁酸发酵。从泸香型白酒厂中分离出的己酸菌，耐气厌氧，发酵乙醇和乙酸盐,产生己酸、丁酸及少量的乙酸。发酵葡萄糖产微量的己酸,与巴克氏己酸菌不同。但是,不管哪一类己酸菌,窖泥中的多种有机酸代谢过程中产生氢，存在着微生物代谢控制的底物抑制现象。二、窖泥中的微生物

（2）兼性厌氧菌（facultativeanaerobe

）1/56硝酸盐还原菌：兼性厌氧菌。如大肠杆菌,只能将硝酸盐还原为亚硝酸盐；如地衣芽抱杆菌（BacillusLichenformis）还能进一步将亚硝酸盐还原为一氧化氮、一氧化二氮和氮。有机物氧化时产生的NADH2

和FADH2中的氢,通过硝酸盐还原菌电子传递链将电子传递给NO3-、NO2-、NO和N2O，最后均还原成氮。二、窖泥中的微生物

（2）兼性厌氧菌（facultativeanaerobe

）1/56硝酸盐还原菌的电子传递链的组成和一般细菌的呼吸链不一样，电子通过电子链的传递只能产生2个ATP。二、窖泥中的微生物

（2）兼性厌氧菌（facultativeanaerobe

）1/56三、窖泥中微生物代谢1/56三、窖泥中微生物代谢

（1）己酸的代谢途径酒精和乙酸合成己酸2CH3CH2OH+CH3COOH→CH3(CH2)4COOH+2H2O酒精和乙酸先生成丁酸，丁酸再和酒精生成己酸CH3CH2OH+CH3COOH→CH3(CH2)2COOH+H2OCH3(CH2)2COOH+CH3CH2OH→CH3(CH2)COOH+H2O淀粉糖化后,先生成丙酮酸,丙酮酸再生成丁酸,丁酸再与乙酸合成己酸C6H12O6→2CH3COCOOH+2H22CH3COCOOH+2H2O→CH3(CH2)2COOH+CH3COOH+2O2CH3(CH2)2COOH+2CH3COOH+2H2→CH3(CH2)4COOH+CH3COOH+H2O醅子在窖池内发酵时,上述反应均有可能发生。在发酵的过程中,主要是己酸菌利用生物酶促进了上述反应的发生,使己酸能够得以大量生成。1/56CH3(CH2)4COOH+ATP+CoA~SH→

CH3(CH2)4CO▪SCoA+AMP+PpiCH3(CH2)4CO▪ScoA+CH3CH2OH→CH3(CH2)4COOC2H5+CoA~SH三、窖泥中微生物代谢

（2）己酸乙酯的代谢途径1/56丁酸菌在代谢过程中产生的氢被甲烷菌和硝酸盐还原菌利用，解除氢的抑制现象丁酸的积累有利于己酸菌将丁酸转化为己酸甲烷菌、硝酸盐还原菌和产酸、产气菌相互偶联，实现“种间氢转移”关系，甲烷有刺激产酸效应；黄浆水中含有大量乳酸，被硫酸盐还原菌利用，消除黄浆水中营养物质不平衡。三、窖泥中微生物代谢

（3）有机酸代谢的调节1/56硫酸盐还原菌，如脱硫弧菌（Desnlforibriovulgaris）能以硫酸盐作为最终电子受体而将硫酸盐还原为H2S。乳酸被脱硫弧菌最后氧化为乙酸,在这个过程中脱下8个氢,这8个氢最后使硫酸盐还原为硫化氢。三、窖泥中微生物代谢

（4）乳酸的代谢1/56窖泥在老化过程中出现白色晶体状物质,经分析为乳酸亚铁及乳酸钙。三、窖泥中微生物代谢

（4）乳酸的代谢硫酸盐还原菌能减少窖泥中微生物产生的乳酸及营养物（黄桨水）中的乳酸,防止乳酸积累,减缓乳酸亚铁及乳酸钙的产生。故窖泥中硫酸盐还原菌的种类及数量,是衡量窖泥是否趋于老化的重要指标。1/56四、主要功能菌群分布及化学生态环境

（1）400余年泸州老窖糟醅中功能菌数量从窖面到窖底越来越多；从窖中到窖壁越来越多。老窖池糟醅中数量最多的窖泥功能菌是己酸菌，其次是醋酸菌、乳酸菌、丁酸菌，甲烷菌最少。窖位间数量差异最大的己酸菌，其次是醋酸菌、乳酸菌、丁酸菌，甲烷菌最少。1/56四、主要功能菌群分布及化学生态环境

（1）400余年泸州老窖1/56四、主要功能菌群分布及化学生态环境

（1）400余年泸州老窖1/56随着窖龄的增加，窖泥中己酸菌、丁酸菌、甲烷菌数量不断增加，同时，窖泥中微量化学成分含量和种类也不断增加，尤其是酯类化合物和酸类化合物。己酸菌、丁酸菌、甲烷菌是浓香型酒主体生香功能菌，揭示了中国浓香型白酒老窖发酵机理。泥窖内壁的窖泥，是酿酒主体生香功能菌(己酸菌、丁酸菌、甲烷杆菌行等)繁衍栖息的场所，是多种微生物固定化的培养基，是没有半衰期且效果越来越好的生物反应器。窖龄越长，窖泥中繁衍的功能微生物及其产生的香味物质也就越多，产出的酒也就越好。1/56枝江大曲选用优质红高粱、糯米、大米、小麦、玉米为原料,以自然接种培养的麦曲为糖化发酵剂,采用传统的泥窖固态发酵、混蒸混烧、续糟配料法进行生产。窖泥和大曲中参与发酵的微生物：霉菌、酵母和细菌。大曲中霉菌主要为曲霉、犁头霉、毛霉、根霉、白地霉；酵母菌以酵母属为主，细菌中有大量菌为芽孢杆菌。四、主要功能菌群分布及化学生态环境

（1）枝江大曲1/56四、主要功能菌群分布及化学生态环境

（2）枝江大曲1/56五、人工窖泥的培养

人工窖泥的制作按其培养物的不同，一般分为有机窖泥和无机窖泥两种有机窖泥采用酯化泥、窖泥母液和窖池内的一些物质等，使窖泥能快速适应窖池环境，同时窖泥中各类微生物菌群丰富，生成产生的香味成分复杂，各类成分协调；无机窖泥由于主要培养己酸菌，所含的微生物菌群较少，生成香味成分单一。1/56五、人工窖泥的培养有机窖泥多以豆类、酯化液、窖内黄水、酒糟等有机氮、磷、钾为微生物的营养源；无机窖泥主要以纯种培养己酸菌为主，多以无机盐类如磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵等无机氮、磷、钾为微生物的营养源1/56五、人工窖泥的培养酵母液自溶液麸皮和水以1∶6的比例混匀，加热至60℃保温3～4h，加入5万单位的糖化酶0.2%，使其糖化2h。干酵母在使用前需复水活化制成酵母乳液，以便恢复酵母细胞的正常功能。将干酵母按1∶10～1∶20的比例投放于36～38℃的温水中复水15～20min，或在2%～4%的糖水复水中活化30～90min，制成酵母乳液。将糖化好的麸皮冷却到35℃后加入2%复水活化后的酵母液发酵24h。将发酵好的酵母液的pH值调整到5.0，加热至50℃，保温40～50h即得到较为理想的酵母自溶液.1/56五、人工窖泥的培养

酯化液的培养:先将晾干的黄泥粉碎，然后加入85℃以上的热水20%，搅拌均匀，立即封坛，保温杀菌。第2天，继续加热水到半缸左右（30%），调节缸内温度在42～45℃之间。以小提桶盛少量热水（不低于45℃）加入老窖泥，捣细成浆，加曲4kg拌匀。混匀后，桶内保持40℃左右，将培养成熟的菌液缓慢倒入缸内搅匀。1/56五、人工窖泥的培养把黄水、母糟、酒尾按比例要求加入缸中搅匀。此时，缸的容量基本达到90%，缸内温度一般控制在39～42℃。封缸发酵以塑料布封好缸口，插入温度计，测量缸内温度，测定封缸温度，保温发酵，发酵全期7～8d。封缸温度控制在38～42℃之间，正常情况下，在20h内，缸内绝大部分都要发酵。发酵开始时，缸内液面上升，1～2h后，开始有气泡，发酵旺盛；30～60min后液面下降，正常发酵的母液是淡黄色，带悬丝，气味与老窖泥相似。1/56五、人工窖泥的培养有机人工老窖的培养要培养好窖泥，窖泥配方是关键，应严格遵循“尽量使用酿酒的下脚料，少添加其他原料”的原则。事实上，酿酒用的下脚料，如黄水、酒尾、封窖泥、粮糟、丟糟等都是酿酒微生物的良好栖息载体，是驯化了的天然微生物培养基。1/56五、人工窖泥的培养两步法窖泥培养操作第一步熟土阶段选好泥土后应进行处理，先过筛，去除土壤中的石块或杂质，将选定合格的黄泥晾晒3～5d，使土壤中的水分达到8%以下，再粉碎成细粉状，拢堆备用。其目的有三：一是阳光照射自然杀菌；二是去除水分，增加土壤对酒尾、黄水液体的接收量；三是排除土壤中杂味。、黄水液体的接收量；三是排除土壤中杂味。测量黄土体积，计算所需材料（豆粕、大曲粉、丢糟），当天所计划的土方和配好的料用完，拌和均匀。整个土堆拌和完毕后，将土堆划分成若干区，一个区为30～50m3，打好土堆，把处理好的黄水、酯化液、酵母自溶液、酒尾等倒入土堆进行浸泡，盖上塑料布，不得有跑漏现象。浸泡过程中，黄水添加量以泥的含水量分次添加，不得过多，使pH值偏低。浸泡期间要保证基质泥的湿润，定期添加黄水，浸泡时间20～30d。1/56五、人工窖泥的培养第二步培菌阶段在浸泡好的基泥中，加入己酸菌液2%～2.5%、酵母自溶液母液1.5%、尾水12.5%、酯化液2%～2.5%，将料倒入基质泥中拌和均匀，一次拌和不完，分数次拌和，当天拌和完的基质泥用塑料布密封。培菌操作是窖泥培养的关键，和泥不均匀必然导致局部发酵，使窖泥长期不能成熟。操作应边添加边拌和，使其混合均匀。培泥要注意季节，北方5月和6月为最适宜的时间，注意保持水温，使和好的窖泥的温度为25～30℃，水分控制为50%左右，pH值约为6.5为宜，和好后，迅速拢堆，密封后在30℃进行培养。1/56五、人工窖泥的培养窖泥发酵后期管理在正常情况下，窖泥收堆后，24h即出现产气，产气量极大，但品温仅升1～2℃，48～96h品温不断上升，5～10d可达32～37℃。经验证明，旺盛期保持越长，窖泥质量越好。此时，要加强窖泥发酵管理，切忌过热过冷，同时，要注意密封，防止漏气，培养30～40d，即为成熟窖泥。1/56五、人工窖泥的培养有机窖泥的质量鉴定培养成熟的窖泥应是色泽乌黑，在阳光下呈荧光，手感湿润、细腻、油滑，搓之无粗糙感，嗅之浓郁芳香，无异臭味或异杂味，镜检杆菌、梭菌多且粗壮。1/56LM800/801Content（%）Drysolid,DS65-70Totalnitrogen,TN9.0-11.5Aminonitrogen,AN4.2-5.5Freeaminoacid,FAA20-25Hydrolyzedaminoacid,HAA35-45MainprocessingpointApplicationdomain1.

washedwithsoftenwater;ItsnutritionalfuntionissimilartoFM802六、窖泥培养中常用的酵母浸出物1/56Baker’sYeastExtractFM803DescriptionThisproductismadefromthefreshbaker’syeastthroughproceduressuchasautolysis,enzymolysis,separation,vacuumconcentrationandspraydrying.Itisveryrichinproteins,peptides,aminoacids,nucleotides,vitamins,traceelementsandsoon.

1/56CharacteristicsRichnutritioncomponentssuitgrowthandmetabolismofmicroorganismandcellfully.Thoroughlydegradatednutritioncomponentspromotegrowthandmetabolismofmicroorganismandcelleffectively.Lightcolorandclearinaqueoussolutionafterautoclavingarebeneficialforcleanproductionandmetabolitesextraction.SteadyqualityandhighperformanceCosteffectiveKosherandHALALcertified,Animal-free,GMO-free1/56PhysicalandChemicaldataValueSolubility(%)0-2%pH(2%solution)5.3-7.2Totalnitrogen(%)≥10%α-aminonitrogen(%)≥5%Moisture(%)≤6%Ash(%)≤15%NaCl(%)≤2%Contentoffree-AA(%)≥33%1/56MainfeatureHighcontentoffreeaminoacidsApplicationsBroadrangeofindustrialfermentationsMediaformulationsSuitableforLacticacidbacteriaandgeneticallyengineeredbacteriamentabolitesAnimalnitrogensourcesubstituteLargescalefermentation

1/56Baker’sYeastExtractFM802DescriptionThisproductismadefromthefreshbaker’syeastthroughproceduressuchasautolysis,enzymolysis,separation,vacuumconcentrationandspraydrying.Itisveryrichinproteins,peptides,aminoacids,nucleotides,vitamins,traceelementsandsoon.

1/56Baker’sYeastExtractFM802DescriptionThisproductismadefromthefreshbaker’syeastthroughproceduressuchasautolysis,enzymolysis,separation,vacuumconcentrationandspraydrying.Itisveryrichinproteins,peptides,aminoacids,nucleotides,vitamins,traceelementsandsoon.

1/56CharacteristicsRichnutritioncomponentssuitgrowthandmetabolismofmicroorganismandcellfully.Thoroughlydegradatednutritioncomponentspromotegrowthandmetabolismofmicroorganismandcelleffectively.Lightcolorandclearinaqueoussolutionafterautoclavingarebeneficialforcleanproductionandmetabolitesextraction.SteadyqualityandhighperformanceCosteffectiveKosherandHALALcertified,Animal-free,GMO-free1/56PhysicalandChemicaldataValueSolubility(%)0-2%pH(2%solution)5.3-7.2Totalnit