木聚糖酶色谱纯化技术的研究进展

木聚糖酶色谱纯化技术的研究进展

木聚糖酶的纯度和纯度是决定木聚糖酶制造成本及其产品竞争力的重要因素。这类典型的生物技术产品的50.90%需要改进。我国木聚糖酶的研究相对滞后,目前还未见产业化生产木聚糖酶的报道。因此,开发具有高回收率,并能获得高纯度酶的大规模经济有效的生物分离纯化方法,将是推动我国木聚糖酶获得实际商业化应用的重要课题。本文简要叙述了目前采用较多的木聚糖酶纯化技术,着重讨论了双水相体系(ATPS)和糖类结合域(CBM)的原理与方法,并就未来发展方向提出自己的观点。1木聚糖酶的纯化微生物产木聚糖酶大部分是通过色谱法最终纯化。由于纯化在生产上的重要性,国际上不少生物技术公司在最近几十年里不断研制出新型的色谱纯化介质及对原有介质填料进行改进。使介质的性能(流速、载量、pH使用范围、化学稳定性、分辨率)大大改进,各种预装柱及高度自动化智能化的仪器的出现也使得纯化更加便捷,致使色谱法成为实验室纯化蛋白质最成熟的技术,也是国内绝大部分木聚糖酶最终纯化所用的方法。木聚糖酶的纯化方案设计依赖于酶的来源、酶所在的位置及最终的所需的纯度。虽然也有不少一步纯化的报道,但大部分都要经过多步实现。一般步骤是粗酶预处理、粗酶沉淀、色谱分离。木聚糖酶纯化的早期步骤通常使用低分辨率、非专一性的粗分离纯化手段如硫酸铵盐析、超滤、透析等以达到浓缩、去大部分杂质和色素的目的;随后常用的色谱有离子交换、凝胶过滤、疏水色谱、亲和色谱和色谱聚焦。使用率最高的是离子交换和凝胶过滤,离子交换基团大多数是以弱离子交换基团DEAE、CM为主,其次是强离子SP、Q等,凝胶过滤主要色谱介质是葡聚糖和琼脂糖及其改良物。SaPereiraP综述66种文献中的木聚糖酶纯化方案:通常需约2～5步的纯化步骤,酶活性回收在0.2～78%之间变动,回收率与步骤的数目成反比,真菌产木聚糖酶活性回收常较细菌的为低,且色谱技术是限制高的酶活回收的因素之一。2cbm卡洛伊木马和纯度2.1糖脂糖的结构和功能变化传统的色谱虽然具有高的分辨率,但多步纯化耗时、回收率低且在大规模纯化上有其局限性。重组蛋白大量表达也需要高效、简便的纯化方法,使得在过去的二十年里许多专一吸附的亲和纯化被提出以尝试取代多步的色谱技术。多肽融合标签是目前在实验室广泛用于重组蛋白纯化的一个有用地亲和纯化工具。多肽融合标签可以有选择性地结合到一个固定在合适基质上的互补配基上,目标蛋白通过基工程和蛋白工程与多肽标签结合成融合蛋白,此融合蛋白经一步亲和层析可得相当高的纯化。江正强薛业敏等用多组氨酸作为标签经过含镍螯合金属亲和色谱纯化木聚糖酶。然而,标签受体与基质交联时复杂的化学修饰、基质循环利用的有限性、高花费在大规模商业上的可行性等因素使得研究者寻求更合适的标签开辟其它新的纯化途径,CBM的应用便是一例。糖类结合域(carbohydrate-bindingmodule,CBM)存在于许多糖苷水解酶包括木聚糖酶中,是结构和功能上独立的的一个非催化的功能区域。许多聚糖水解酶常包含着一个催化区域和通过连接序列相连的一到多个的CBM。第一个被鉴定的CBM是结合晶体纤维素的,因此定义为纤维素结合域(cellulose-bindingdomain,CBD)。研究揭示不同的CBM有着不同的配基专一性及不同的结合位点,可结合到包括甘露聚糖、葡甘露聚糖、木聚糖、葡聚糖、单链纤维素、晶体纤维素、非晶体纤维素等糖类上。CBMs有选择的配基结合为其发展亲和纯化提供了有利的条件。来自Streptomycesolivaceoviridis木聚糖酶C-端的CBM13,带有三个亚结构域(submodain)α、β、γ,每一个亚结构域上有单糖或二糖的结合点,α亚结构域对乳糖有较强的结合能力,乳糖化-琼脂糖亲和色谱一步纯化此木聚糖酶到单一组分。一般认为这些功能区域即使彼此分开仍能执行其功能,因此许多功能CBM通过基因操纵技术进行独立地表达,用来分析其结构和生化性质。MangalaSL等的研究表明把从Clostridiumstercorarium木聚糖酶分离的CBM通过蛋白工程结合到无CBM的Bacillushalodurans碱性木聚糖酶上并不影响原有酶对可溶性糖活力及和PH性质,却使之增加了对燕麦木聚糖的亲和力和活性,可溶性糖可使它解吸。BeatrizRodriguez等的研究也证明来自Staphylococcusaureus的蛋白A活性并不受与CBM结合的影响。具有这种特点的CBM对于用它来作为一种亲和标签是有用的。蛋白酶酶切下的CBM,通过蛋白质工程与待分离蛋白融合形成融合蛋白,或基因工程构建含CBM标签的重组蛋白,在不影响原有酶活性情况下亲和色谱分离目的蛋白。MojganKavoosi等利用T.maritima木聚糖酶的CBM9-2与不溶性纤维素的亲和性,成功地一步纯化了含CBM标签的重组蛋白。然而,酶与多糖间的作用机制目前是不明确的,也有报道克隆CBM在宿主内的糖基化与否影响到它与纤维素的亲和力。CBM肽与目标多糖之间的识别吸引了极大的关注,对它的进一步了解必将促进它的应用。2.2cbd-mb-bbCBM按其氨基酸序列的相似性可分为33族,这些族按其结构、功能、结合的专一性可分为a、b、c三类。结合到纤维素上的CBM(cellulose-bindingdomain,CBD)在纯化上有着巨大潜力。CBD在纤维素酶、木聚糖酶等多糖水解酶中的广泛存在被认为是适应环境的结果。植物细胞壁中纤维素含量占了很大一部分,CBD的存在使得这些酶结合在不溶性纤维素上形成多酶聚集体,导致了酶之间的协同作用,也使得局部酶有效浓度增加,促进了细胞壁物质的分解。CBD可分成13个族,族之间在性质上有着显著的差异,在大小上处于4～20KDa,在位置上有很大的变动性,可发现于肽链N端、C端和中间。根据其差异和所用特定的CBD,选择适合的条件如PH、竞争性配基等可用来使其和基质解吸。CBD可专一地吸附于可溶或不可溶的纤维素上。一些CBD不可逆地结合在纤维素上,此类CBD可用于固定化。具有此CBD的木聚糖酶或者含此CBD标签的酶可固定到纤维素上。另一些CBD可逆结合到纤维素上,可作为一种亲和标签,在分离和纯化上更为有用。CBD用作亲和标签的一个重要好处是不需要基质纤维素的活化,免除了危险化学药品如溴化氰的使用。而且作为大规模的纯化程序,纤维素是一种理想的基质:化学惰性,良好的物理性质,对非专一性蛋白低亲和力,可广泛制成各种不同的形状和大小,医疗安全、价格便宜等。这些优势使许多研究者意识到了CBDS在生物技术上的巨大应用前景。3两个水相系统和纯水3.1木聚糖酶atps双水相系统(AqueousTwo-PhaseSystem,ATPS)是20世纪60年代被提出用于分离生化物质的一项液-液提取技术,经过几十年发展,现已广泛用于分离细胞、生物膜、病毒、蛋白质、核酸和其它的生物分子。由于具有操作简易、高载量、相系统一步生成、相物质可再循环、易规模化等优点,使ATPS成为最有工业化潜力的一门技术。又由于分离体系双水相、条件温和、生物兼容性等原因使其在酶等活性物质分离上有重要的应用价值,目前用ATPS被分离的酶已有几十种。在应用于木聚糖酶纯化上有较成功的探讨[17,18,19,20,21,22,23,24,25]。ATPS主要是通过混合两种水溶性高聚物溶液或者一种高聚物溶液和一种盐溶液形成,一般认为只有两种高聚物有疏水性差异时才会形成分开的两相。物质在两相中分离依赖于物质本身的性质(分子量、电荷、疏水性、亲和专一性、构象)、形成两相系统的成分(高聚物组成、分子量、摩尔比)、系统环境(温度、PH值)和离子(NaCl)的浓度。在ATPS中,目前最常用的两种系统,即聚乙二醇/葡聚糖体系和聚乙二醇/磷酸钾体系。这两种系统由于无毒被广泛由于各种物质的分离与研究中。3.2木聚糖酶活性回收在现有报道中利用ATPS分离木聚糖酶大多在一步至二步就达到相当高的纯化,甚至操作工艺的连续化和半连续化,也有应用于木聚糖酶发酵的报道。Gaikaiwarietal.较早用ATPS分离来自Bacillussp的木聚糖酶,酶液两次经过ATPS,第一次8%磷酸盐,16%PEG8000,第二次12%磷酸盐,8%PEG8000。结果是85%的活性回收和只有1.2倍的纯化。MonicaAndreaBim利用聚乙二醇(PEG)/磷酸钾盐系统纯化来自Bacilluspumilus的木聚糖酶,研究了12个包含不同的PEG分子量、PEG浓度、磷酸盐浓度、氯化钠浓度的ATP系统,结果在最优22%PEG6000,12%氯化钠、10%磷酸盐下木聚糖酶活性回收达95%和相当高的纯化,.木聚糖酶聚集在PEG富集的上相。M.C.T.Drarte在8%K2HPO4,16%PEG6000,12%NaCl的ATPS一步浓缩和纯化碱性木聚糖酶,可实现41%的活性回收和57的纯化倍数,木聚糖酶集中在底相。3.3两个水相系统pts的组合3.3.1peg-eudragits-100和磷酸盐系统ATPS和其它技术的结合使得ATPS工艺更为高效、连续和经济,双水相亲和沉淀技术便是其中的一种。SunitaTeotia,R.Lata等在PEG/磷酸盐系统中加入了木聚糖酶的亲和配基EudragitS-100,EudragitS-100是一种可逆溶-不溶性的丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物,不溶于酸性,但中性和碱性中可溶,形成了PEG-EudragitS-100/磷酸盐两相系统,此系统分离来自Aspergillusniger和Tichoderma-reeseiandBacillusamyloliquefaciens的木聚糖酶,前者纯化56倍,活性回收达93%,后者达32倍,活性回收达93%。木聚糖于与EudragitS-100结合在PEG富集相,利用EudragitS-100在PH5.5以上是可溶于水和PH4.5以下完全沉淀的特点,降低PH值沉淀出EudragitS-100与酶的结合物,用1MNaCl使酶与EudragitS-100解吸。3.3.2蛋白质工程对聚合物疏水性的影响从现有的研究表明,影响ATPS的分离系数的因素是很多的[17,27,28,29,30,31,32,33,34]。使得具体到每一种蛋白时必须有针对性地优化ATPS参数以达最大的分离效果。在ATPS中,蛋白质中有些氨基酸对分离系数有着重要的影响。尤其是疏水性氨基酸。FexbyS等研究把不同长度和成分的短肽的用基因技术融合到乳酸脱氢酶的N-端上以观察其疏水性及在ATPS中的分离,结果表明疏水性的差异与ATPS中的分离效果密切相关。荧光蛋白和乳酸脱氢酶在N-端融合了三个酪氨酸,在ATPS中分离效果更好,如脯氨酸接在酪安酸标签和蛋白质之间,分离系数会更增加。作者认为可能原因是脯氨酸的刚硬结构增加了疏水标签暴露至环境中,结果分离系数大大增加了。色氨酸标签蛋白在ATPS中促进分离也与它在系统中暴露于ATPS表面活性剂富集相中有关。说明蛋白质的疏水性对在双相系统中的分离有促进作用。Nilsson.ALinder.M.B等人的研究也都证明物质疏水性与在ATPS中的有效分离有很大的关系。疏水作用具有高的选择性,其差异能被用做有效手段为简化蛋白质分离,蛋白质的疏水性通过小的基因修饰如定点诱边或与疏水肽标签的融合很容易地改变,一些蛋白质一端接上疏水氨基酸标签,即使只增加分子量的1%,改变等电点2%也会对其疏水性有很大的影响。在已报道的木聚糖酶纯化方案里,有相当一部分用到疏水层析,利用酶本身疏水性差异或者在不影响酶活性的前提下通过蛋白工程改变待分离酶的疏水性,这种蛋白质工程与双水相系统的结合将使分离效果得到提高。与传统的亲和标签相比,疏水肽标签有一个重要的好处是开挖简单、并不昂贵生物分离材料的可能性,是一个重要的工具。3.3.3金属离子表面活性剂ATPS与亲和技术的结合也是未来的一个发展方向,ATPS由于载量大,选择性较低,如在成相剂(聚乙二醇)上接上待分离蛋白的亲和配基,则可大大地提高了专一性,目前可接上去的配基有活性染料、金属离子、蛋白质配体等。在这亲和ATPS里,许多酶被纯化。Lam,H等用ATPS分离蛋白标签CBM9-GFP,此标签是绿荧光蛋白(GFP)与多糖结合域(CBM)的连接体,目的是研究CMB蛋白标签在亲和ATPS中的分离效果。一种葡萄糖衍生而来的非离子表面活性剂C(10)G(1)既是成相剂又是CBM的亲和配基,在水溶液中形成胶束两相系统,竞争性抑制剂葡萄糖可阻断CBM与配基的亲和性,被加入的作为对照。结果是CMB与表面活性剂的亲和使分离系数高于对照组6倍,表明此亲和ATPS有可能应用于任何含CBM标签的重组蛋白质分离及具有CBM的酶的分离。4eudragits-100和k-roy三相系统与ATPS的不同在上下相之间有一界面相。AparnaSharma,M.N.Gupta用三相系统纯化来自Aspergillusniger的木聚糖酶,其操作是木聚糖粗酶与亲和剂EudragitS-100溶液混合,加入低于盐析浓度的30%硫酸铵溶液,再以等体积加入有机溶剂正丁醇,有机溶剂的加入把蛋白质推出溶液,结果上相是有机溶剂相,下相是水相,在两相的中间形成一层蛋白质沉淀界面,沉淀相是EudragitS-100和酶的结合物,1M的NaCl使酶与EudragitS-100分离,其木聚糖酶活性回收达60%,纯化倍数达95倍,直接达到电泳纯。IpsitaRoy等用三相系统纯化已被8M尿素/100mM二硫苏糖醇变性的Aspergillusniger木聚糖酶,达到了21倍的纯化倍数和93%回收率,且实现了变性木聚糖酶的复性。此方法可借鉴于纯化木聚糖酶重组蛋白超量表达时形成的包涵体。5木聚糖酶纯化EveraldoSilvinoDosSantos等人曾尝试用扩张床吸附技术(Expan