第二章全能性

第二章细胞全能性与形态发生细胞全能性及其表达器官发生体细胞胚胎发生第一节细胞全能性及其表达细胞全能性概述细胞脱分化细胞再分化一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。一.细胞全能性概述第一节细胞全能性极其表达1900年孟德尔定律的重新发现使人们认识到,染色体是遗传因子的载体。细胞具有同样数目的染色体，每个细胞自然就携带了彼此相同的全部遗传因子，因此也应当像受精卵一样，具备分化和发育的潜能。1902年Haberlandt发表了著名论文《植物细胞离体培养实验》指出:作为高等植物的器官和组织基本单位的细胞有可能在离体培养条件下实现分裂分化，乃至形成胚胎和植株。这种见解后来被称为细胞全能性学说（celltotipotency）。细胞全能性提出与实验证明第一节细胞全能性极其表达细胞全能性的相对性不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。第一节细胞全能性极其表达植物细胞按照分裂能力分为三类：第一类是胚性细胞－植物干细胞。在自然界表现出胚性的细胞可以分为三大类，即：早期胚胎细胞、茎端分生细胞和成熟组织中遗留的胚性细胞。如茎尖、根尖及形成层细胞；第一节细胞全能性极其表达第二类是永久失去分裂能力的终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的Go细胞。如表皮细胞及各种薄壁细胞。一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。第一节细胞全能性极其表达根据细胞所处组织从强到弱：

顶端分生组织>居间分生组织>侧生分生组织>薄壁组织(基本组织)>厚角组织>输导组织>厚壁组织。

根据细胞类型从强到弱：

营养生长中心>形成层>薄壁细胞>厚壁细胞(木质化细胞)>特化细胞(筛管、导管细胞)；第一节细胞全能性极其表达细胞全能性脱分化细胞分裂再分化个体再生细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前题，再分化是细胞全能性表达的最终体现。第一节细胞全能性极其表达二.细胞脱分化

培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化（dedifferentiation）。离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前。静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。第一节细胞全能性极其表达细胞生理与结构变化细胞脱分化调控机理细胞分裂与愈伤组织形成第一节细胞全能性极其表达细胞生理与结构变化烟草栅栏细胞完成脱分化第一次分裂，形成二细胞结构烟草栅栏细胞分裂过程烟草海绵细胞分裂过程第一节细胞全能性极其表达

细胞的脱分化过程可分为3个阶段：

启动阶段：液泡蛋白体出现是启动脱分化的标志

演变阶段：此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；终结期：细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即开始。培养72小时后，来源于一个栅栏细胞的分生细胞团第一节细胞全能性极其表达细胞脱分化的调控机理细胞周期对脱分化的调控PSK的发现及其对细胞脱分化的影响激素诱导表达基因与细胞脱分化细胞脱分化与染色体解凝聚第一节细胞全能性极其表达细胞周期调控（Hartwell；Hunt和Nurse，2001）cyclinCDKcyclin-dependentkinaseCKIcyclin-dependentkinaseinhibitor细胞周期第一节细胞全能性极其表达细胞脱分化调控的实质即是G0期细胞回复到分裂周期的调控过程细胞周期

植物细胞周期的调控2类CDK（CDKa、CDKb）2类cyclin（CycB、CycD）CycD基因首先表达生成CycD，在相关调节因子的帮助下CycD与CDKa结合形成CDKa/CycD复合体使CDKa活化，进而对Rb（G1期限制点调控分子）磷酸化，使细胞通过“限制点”进入分裂周期。当细胞进入分裂周期后，则由CDKb与CycB以及相关的调节蛋白完成从S期到M期的调控。

Boucheron等（2002）将细胞周期基因CDC2a的启动子与GUS连接，构建质粒转化烟草，发现CDC2a只在启动有丝分裂的细胞中表达，说明CDC基因家族参与调控成熟细胞的脱分化过程。揭示启动脱分化过程的相关基因及其表达将有助于了解克隆的机理和癌症的起因，是生命科学的前沿领域。与植物激素相关的基因表达与细胞脱分化激素2,4-D诱导表达的基因par

（Takahashi等，1989），在细胞从G0期转入S期的早期启动中具有功能性作用。花粉富含硫蛋白(pollen-abundantphosphoproteins)基因NtEPa，NtEPb，NtEPc

（Kyo等，1988）。激素对细胞脱分化的调控涉及到复杂的信号转导第一节细胞全能性极其表达1996年首次发现PSKα,PSKβ（Matsubayashi和Sakagami）PSKPSKα在低细胞密度下能促进细胞启动分裂PSKα基因的表达受NAA诱导在PSKα基因表达的同时细胞才能启动分裂第一节细胞全能性极其表达水稻细胞质膜存在有120kD和160kD的PSKα的蛋白质受体。烟草120kD蛋白为一受体激酶，含有一个胞外富亮氨酸重复结构域和一个信号转导结构域，与PSK高度亲合。过量表达受体蛋白基因，能显著提高愈伤组织生长PSK第一节细胞全能性极其表达染色体第一次解凝聚第二次解凝聚（引自Zhao,2001)烟草叶肉细胞脱分化过程中染色体有2次解凝聚过程细胞脱分化与愈伤组织形成细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂，对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂发生在细胞完全脱分化之后器官，组织培养时细胞分裂首先发生在伤口部位第一节细胞全能性极其表达有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。在组织器官培养时，愈伤组织内的细胞脱分化程度不一致愈伤组织的形成是脱分化的细胞重新进入活跃分裂的结果，但不是脱分化的过程第一节细胞全能性极其表达第一节细胞全能性极其表达愈伤组织形成细胞学变化细胞分裂细胞脱分化标志：出现液泡蛋白体；质体转换；核移向中央细胞结果再分化个体再生细胞全能性脱分化细胞分裂细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前题，再分化是细胞全能性表达的最终体现。第一节细胞全能性极其表达所谓细胞分化（Differentiation），是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，因此，通常把离体培养下的这一过程称为再分化（redifferentiation）。三.培养细胞再分化第一节细胞全能性极其表达从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的不同表现型。第一节细胞全能性极其表达TE分化及其调控激素在细胞分化中的作用极性与细胞分化第一节细胞全能性极其表达所谓极性（polarity）是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。极性与细胞分化第一节细胞全能性极其表达Fucus合子细胞不均等分裂及其早期发育

在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。（引自Bouget等，1998）

极性的建立是维管发生的信号，极性建立后生长素按极性方向流动，导致TE细胞分化通常把离体培养中TE（TEtrachearyelements）细胞的出现作为组织分化的标志TE细胞分化为植物细胞分化研究提供了模式体系TE的形成与细胞分化第一节细胞全能性极其表达激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素激素对细胞分化的调控作用生长素和细胞分裂素、GA3、ABA、乙烯第一节细胞全能性极其表达（Camus1949年）第一节细胞全能性极其表达细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用.它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。如果处理的先后次序不同，则影响分化效果。先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高。第一节细胞全能性极其表达越来越多的研究显示，植物激素对细胞生长与分化的调控是一个复杂的级联调控过程，离体培养条件下，由于外植体细胞所处的生理状态不同以及内源激素水平的差异，试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困难的。第一节细胞全能性极其表达细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程。morphogenesissomaticmorphogenesis细胞全能性脱分化细胞分裂再分化个体再生前题结果第二节器官发生植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的过程。第二节器官发生不定根、不定芽是指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织上发生的根和芽。器官发生方式器官发生过程起始材料对器官分化的影响激素对器官分化的调控光照对器官分化的影响器官分化的基因调控先芽后根

先根后芽

根芽同步发生

器官发生方式第二节器官发生经过愈伤组织的器官发生不经过愈伤组织的器官发生器官发生过程第二节器官发生经过愈伤组织的器官发生过程愈伤组织形成生长中心形成器官原基及器官形成第二节器官发生芽形成第二节器官发生不经过愈伤组织的器官发生外植体不经过典型愈伤组织形成器官，有两种情况：茎尖培养中芽形成外植体直接发生芽第二节器官发生a.细胞第一次平周分裂b.生长中心形成c.原初分生组织d.芽原基形成发生过程影响器官发生的因素外植体类型及其生理状态母体植物的遗传基础起始材料第二节器官发生总体上说，被子植物比裸子植物容易培养，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。无性繁殖植物在培养条件下有较强的器官分化的能力同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异影响因子—遗传背景。第二节器官发生不同基因型大豆上胚轴器官分化能力基因型（品种/自交系）

愈伤组织诱导率（％）器官分化率（％）资料来源

汾豆339434程林梅等，2001晋豆199328晋遗219122晋豆119320汾豆389323汾豆179323汾豆519216晋早1259112影响因子—遗传背景玉米不同自交系幼胚培养器官分化能力基因型愈伤组织诱导率（％）

器官分化率（％）

资料来源

34010078杜娟等，2002792210086Mol17100624112100538902100578461003847710047吉85310011吉921100324441000.4影响因子—遗传背景不同部位的的细胞培养反应有较大差异影响因子—生理状态对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。以自然繁殖器官为外植体更易成功。第二节器官发生外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的生长素与细胞分裂素在离体器官分化调控中占有主导地位GA3,PSK在器官分化中也具有一定调控作用影响因子—激素第二节器官发生生长素/细胞分裂素比值高生长素/细胞分裂素比值低生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体影响因子—激素第二节器官发生影响因子—激素培养过程中，细胞对外源激素的吸收效率和代谢途径直接影响激素的活性从而影响其培养效果。外源激素进入细胞内以后，以自由和束缚两种形式存在。第二节器官发生影响因子—激素细胞分裂素被外植体吸收后，在细胞内以自由碱基形式和核甘形式两种形式存在。通过细胞分裂素氧化酶对侧链的修饰可能是植物组织细胞中降低细胞分裂素活性的主要机制。第二节器官发生影响因子—激素第二节器官发生Yakovleva等，（1997）生长素进入细胞后，一部分以游离状态存在，另一部分则与氨基酸结合形成生长素－氨基酸复合体。与生长素结合的氨基酸主要为天门冬氨酸，也有谷氨酸。影响因子—激素第二节器官发生

外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量*培养时间外源生长素浓度生长素游离形式（ng/gFW）总浓度（ng/gFW）1周2,4-DNAA[2H4]IAA23,247.4±3,912.799.3±9.730.3±3.521,979.4±2,526.31,776.7±50.17,557.0±279.04周2,4-DNAA[2H4]IAA20,003.8±4,365.964.8±17.53.4±1.433,119.4±3,835.01,637.0±509.8763.5±420.0*引自Ribnicky等1996。影响因子—激素影响因子—激素在柑橘培养细胞中激素自由态含量变化**引自Jimenez等2001。光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。影响因子—光照第二节器官发生培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。影响因子—光照连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和形态发生。基因调控

homebox细胞周期基因

其它第二节器官发生Homebox基因是一类与系统发育有关的基因Kn1（KNOTTED1）是从玉米中鉴定出的第一个植物homebox基因，Kn1-like只在分生组织中表达。STM（SHOOTMERISTEMLESS）基因以及它们的直系同源（orthologues）基因均参与了茎尖分生组织的分化调控。Homeobox基因可能通过一些调节因子（如激素）介导调控器官分化。homebox第二节器官发生植物编码细胞周期依赖性激酶基因cdc2在离体培养中，调节细胞进入分裂状态的过程起着关键性作用在玉米和大麦离体培养中，cdc2的表达高峰发生在不定芽形成的过程中，在培养初期的表达量较少，该基因的表达部位处于分生组织的外层细胞。细胞周期基因

第二节器官发生CLV(clavate)为拟南芥棒状基因，有3个等位基因CLV1,CLV2,CLV3，突变后SAM膨大呈棒状CLV1编码一个receptor-likekinase(RLK),CLV2编码一个含LRR但没有激酶结构的受体蛋白，与CLV1形成异源双体，CLV3编码一个小分泌蛋白，CLV3能够与CLV1和CLV2形成的受体结合，并激活受体中的激酶。第二节器官发生茎分生组织的CLV基因系统WUS(wuschel)，编码一个含有同源异型结构域的转录因子。WUS在胚胎16细胞期即有表达，WUS突变SAM结构紊乱，干细胞全部丧失。WUS表达集中在L1-L3以下的小部分细胞内，在突变体中，WUS表达向上和四周扩散。clv1和clv3突变株，WUS表达向上移动一层细胞第二节器官发生茎分生组织的CLV基因系统第二节器官发生茎分生组织的CLV基因系统分生组织结构与干细胞数量调控Banno等（2001）从拟南芥根培养再生芽的体系中克隆了一个增强芽再生能力的基因ESR1，将该基因与35S启动子连接转化拟南芥，在有细胞分裂素存在的情况下转基因外植体可以显著提高不定芽的分化率。而生长素不能诱导该基因表达，同样也不能提高不定芽分化频率。其它第二节器官发生从拟南芥温度突变体中鉴定出3个与离体器官发生有关的基因SRD1、SRD2和SRD3，当它们发生隐形突变时，在离体培养中表现出器官发生在不同时期受阻，3个基因均定位于I号染色体上。其它第二节器官发生Low等（2001）通过RT-PCR技术克隆了一个含有亮氨酸拉练基因bZIP（PKSF1），该基因编码一个亮氨酸拉链转录因子，其表达发生在芽形成之前，在有不定芽形成的愈伤组织中其表达量比非分化愈伤组织高6倍其它第二节器官发生这一定义有以下几方面的界定：其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。第三节体细胞胚胎发生离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。体细胞胚的形成体细胞胚的发育与结构特点影响体细胞胚发生的因素体细胞胚发生的生化与分子基础第三节体细胞胚胎发生一.体细胞胚的形成直接途径间接途径第三节体细胞胚胎发生体细胞胚从外植体上直接发生1.诱导阶段2.胚胎发育阶段（兰草，Chen等，1999）第三节体细胞胚胎发生经过愈伤组织的体细胞胚形成经过悬浮细胞的体细胞胚形成间接发生第三节体细胞胚胎发生诱导愈伤组织形成愈伤组织胚性化球性胚形成子叶胚期（蝴蝶兰，Lin等，2000）愈伤组织第三节体细胞胚胎发生愈伤组织胚性愈伤组织悬浮培养的胚性细胞团球性胚形成成熟子叶胚（A.koreanum,Choi等，1997）悬浮细胞第三节体细胞胚胎发生体细胞胚发育的细胞学特点体细胞胚的结构特点二.体细胞胚的发育与结构特点第三节体细胞胚胎发生类似于植物合子胚的发育早期原胚发生胚胎细胞发生球形胚形成完整胚结构形成（咖啡，Fifueroa,2002）类似于动物胚胎早期的发育胚胎细胞发生发育早期2次均等分裂胚结构的形成（咖啡，Fifueroa,2002）结构特点—

与器官发生比较第三节体细胞胚胎发生一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。子叶常不规范。体积明显小于合子胚，在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异。并且，体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程。没有明显的休眠期一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株。结构特点—

与合子胚比较第三节体细胞胚胎发生三.影响体细胞胚发生的因素激素的调控作用培养基及培养条件的影响基因型的影响第三节体细胞胚胎发生2,4-D是应用最为广泛的生长素。球形胚期形成的生长素极性运输对于体细胞胚的进一步发育尤为重要。激素的调控作用细胞分裂素在促进细胞分裂，维持分生组织正常发育具有重要作用。第三节体细胞胚胎发生培养基中的氮源亦会显著影响离体条件下的胚胎发生，体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。培养基及培养条件的影响Vesco和Guerra在Feijoa植物体细胞胚诱导的试验也证明，培养基氮源影响体细胞胚的发生频率。在NH4+和NO3-（15:34）的培养基中，每个外植体的体细胞胚可达10个以上，而培养基只有NH4+或NO3-时，体细胞胚发生频率很低。第三节体细胞胚胎发生一些体细胞胚规模生产模式的试验还发现，球形胚形成后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。Choi等（2002）在西伯利亚人参（E.senticosus）培养中证明，在体细胞胚培养后期，降低培养基无机盐浓度，可显著提高体细胞胚的成苗率。在一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。第三节体细胞胚胎发生Lee等（2001）在改进胡萝卜体细胞胚生产程序的试验中，在胚性愈伤组织形成后，改用只含1/2MS无机盐浓度的培养基，可显著提高体细胞胚形成率。Choi等（2002）在E.senticosus培养中也证明，在体细胞胚培养后期，降低培养基无机盐浓度，可促进体细胞胚的成熟。第三节体细胞胚胎发生基因型的影响马铃薯不同基因型体细胞胚形成能力比较(SeabrookandDouglass,2001)第三节体细胞胚胎发生内源激素调控基因特异蛋白四.体细胞胚胎发生的生化与分子基础第三节体细胞胚胎发生外源生长素的对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。内源激素Ribnicky等在胡萝卜上胚轴培养中证明，体细胞胚形成初期细胞内具有较高浓度的游离态生长素，外源2,4-D和NAA比IAA诱导体细胞胚效果好，外源IAA对内源IAA合成有反馈抑制是其根本原因。第三节体细胞胚胎发生胡萝卜胚发育过程中内源IAA的变化发育时期胚大小（μm）IAA浓度（ng/gFW）自由态结合肽总含量受精前子房受精前子房受精后子房受精后子房球形胚晚期/心形胚早期鱼雷形胚早期鱼雷形胚晚期

75-12575-125125-225400-500900-110015±428±5608±69504±522060±69624±527±42257±4241962±5634986±5951063±4827490±3440824±386796±2922272±4131990±4835594±5821567±4639550±4126848±392823±289内源激素生长素不仅影响体细胞胚的早期发生，同时也影响体细胞胚的后期发育。生长素对体细胞胚后期发育的影响是通过极性运输实现的。内源激素在合子胚的发育中，极性运输严重影响胚形态的建立。Liu等（1993）在拟南芥幼胚培养体系中证明，如果生长素由球形胚期的轴向对称转向心形胚期的两侧对称极性运输过程受阻，则导致子叶异常发育成筒状子叶。已克隆的pin同源基因研究显示，生长素极性运输及其对胚胎发育的调控，是一系列胚胎发育相关基因有序表达的结果。第三节体细胞胚胎发生有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分变化研究显示，体细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加。特异蛋白第三节体细胞胚胎发生

水稻不同愈伤组织（干重）可溶性蛋白质含量（μg/mg）可溶性蛋白质胚性愈伤组织非胚性愈伤组织继代10次的愈伤组织水溶性蛋白质盐溶性蛋白质醇溶性蛋白质碱溶性蛋白质136.330.010.613.294.517.614.414.4115.324.510.913.6特异蛋白（李中奎，1993）伴随体细胞胚发育的特异蛋白植物特异蛋白蛋白类型资料来源胡箩卜E1,E2未知Sung和Okimoto（1983）

苜宿50KD膜蛋白小麦，枸杞

49KD,35KD未知邢更生等（1999）

水稻51KD,68KD未知方继朝等（1994）

特异蛋白阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）是植物中广泛存在的糖蛋白，且可能作为调控蛋白调控某些基因的转录。利用一系列单克隆抗体已鉴定出一些与特殊发育相关和特殊组织相关的