原发性开角型青光眼患者房角组织内谷氨酰胺转移酶的表达

原发性开角型青光眼患者房角组织内谷氨酰胺转移酶的表达

由谷氨基丙烯酸酯（tg）生产的组织丙烯酸酯旋转酶（tg）是谷氨基酸转移酶家族的成员之一。它的作用主要有：(1)催化蛋白交联形成蛋白聚合物，这一作用是Ca2+依赖性的，并且可导致异肽键的增加，可高度抵抗机械和蛋白质水解的破坏，有显著的生理及病理学意义。(2)tTG是一种惟一存在于细胞溶质中的（谷氨酰胺转移酶transglutaminase,TG）家族成员，除了催化蛋白质的交联作用外，它还有结合并水解GTP和三磷酸腺苷的活性。因此tTG是个双功能酶。tTG分布广泛，在不同的组织细胞中，在细胞的不同部位发挥不同的作用，参与多种生理和病理过程。已有研究发现，tTG在眼内也有表达，并且在多种眼部疾病的病理生理过程中发挥重要作用，并且多种促纤维化因子(如TGF2β1、IL21等)均可刺激tTG的表达。开角型青光眼患者前房内和小梁细胞高表达转化生长因子-β（TGF-β）,可促进小梁细胞外基质的合成。本实验以开角型青光眼患者为对象，观察原发性开角型青光眼（primaryopenangleglaucoma,POAG），原发性闭角型青光眼（primaryangleclosureglaucoma,PACG）以及正常人的房角组织中tTG的表达差异。1材料和方法1.1含含含光血眼病例的患者取得患者同意后，收集开角型青光眼患者26例，26眼。闭角型青光眼17例，17眼，且年龄均在24～45岁。收集病例均为原发性青光眼，无其他眼病，尚未发现其他系统疾病。来源于武汉市协和医院眼科青光眼手术中取出的组织。正常眼3例，来源于角膜移植术供体眼。1.2免疫组织化学手术中取出的组织迅速放在10%的中性福尔马林溶液中固定，过夜。在梯度酒精中脱水，用等分的无水酒精和二甲苯透明，等分的二甲苯和石蜡混合浸透30min，石蜡Ⅰ，Ⅱ各浸透2h，石蜡包埋，切片。加入抗tTG抗体（由武汉晶美公司提供）用SP法进行免疫组织化学染色，加入SP试剂。37℃，30min,DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，树胶封片。1.3pt-pcr检测方法根据序列分析的结果合成tTG的引物，以β-actin作为半定量参照。1.3.1步骤1提取1g将同一组的样本一起用匀浆器捣碎，应用Trizol试剂盒(美国Gibco公司产品)提取组织块中的RNA。1.3.2基于dntp的cdna取蒸馏水8μl、随机引物2μl和5倍反应缓冲液8μl，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP)混合物为2μl(10mmol/L)，取RNA酶抑制剂20μl、逆转录酶10μl(美国Promega公司产品)和RNA10μl，于42℃水浴中反应30min，制备cDNA。1.3.3pcr扩增条件及条件(1)tTG引物均来源于上海生工。tTG引物序列：上游5′-CCTTAGTTGCCTATGCTGA-3′，下游5′-CAGTGCTCGCTGTTTGTAG-3′，扩增后片段长度为433bp。(2)PCR反应体系：蒸馏水16.5μl，上下游引物各1μl,10倍反应缓冲液2.5μl,15mmol/LMgCl21.5μl,dNTP混合物0.5μl(10mmol/L)，DNA聚合酶1μl(加拿大Sangon公司产品)，cDNA1μl。阴性对照不加cDNA。(3)PCR扩增条件：95℃变性1min,53℃退火40s,72℃引物延伸40s,30次循环。(4)产物观察与鉴定：扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，于紫外线箱中观察并照相记录。相对分子质量标准物，同时扩增产物纯化后送大连TaKaRa公司进行测序。2结果2.1u3000结语开角型青光眼组免疫组织化学显微镜下可见到小梁细胞中、角膜基质中深褐色的点片状着色，位于细胞质内，异于色素颗粒。而闭角型青光眼患者及正常组的房角组织的免疫组织化学图片中，见整个房角组织着色少，胞质较透明。见图1。正常组、闭角型青光眼组和开角型青光眼组房角组织tTG的表达免疫组化结果如下：对免疫组织化学所的图片进行光密度分析：正常组光密度值为0.180±0.032,POAG组光密度值为0.325±0.052,PACG光密度值为0.012±0.019。进行方差齐性检验，证明方差齐。正常组与闭角型青光眼组房角tTG的表达差异并无显著性（P>0.05），而正常组与开角型青光眼，闭角型青光眼与开角型青光眼之间差异有显著性（P<0.01,P<0.05）。2.2ttg/-actin的测定RT-PCR产物电泳结果显示如图2，正常对照组、闭角型青光眼组和开角型青光眼组，将tTG/β-actin的灰度值相比较，其结果与免疫组化测试结果一致。3开角型光栅光管热tgtTG释放到细胞外基质中，并发挥其蛋白交联作用，使细胞外基质蛋白交联而抵抗降解，其作用底物有纤维连结蛋白，层粘连蛋白、Ⅲ型胶原，vitronectin等，因而造成ECM堆积。由于tTG的增加使得ECM发生堆积，最早Rohen和Witmer将这些沉积物描述为“斑块样物质”（SD斑）。随着SD斑的形成增多，最终导致小梁网和Schlemm管发生狭窄甚至堵塞，使房水外流阻力增加，眼压增高。另外，金属蛋白酶（MMP）是一类锌离子依赖性内源性蛋白水解酶，主要功能是降解细胞外基质和基底膜，而tTG可优先结合MMP-2的激活物，使MMP-2生成率下降。MMP的减少使得ECM降解减少，也有可能导致房水外流阻力的增加。POAG患者前房内和小梁细胞高表达转化生长因子TGF-β，而有研究发现TGF-β可诱导tTG表达增加和分泌，本实验中可发现POAG患者房角组织中tTG的表达与PCAG患者和正常眼中tTG表达有统计学差异，提示tTG的高表达可能与POAG的发病有关。还有研究表明tTG同时也可能增强的活化，而TGF-β又反过来作用于tTG，使其增加。那么就可能形成一个恶性循环。而POAG患者房水中高表达的TGF-β，也更加解释了POAG与PACG患者房角组织中tTG表达的差异。本实验检测到tTG在开角型青光眼患者房角组织中的表达增加，可能与开角型青光眼的发病有关，从发病机制的角度