猪精液冷冻及xy精子分离技术的应用

猪精液冷冻及xy精子分离技术的应用

20世纪30年代，人们开始在猪上使用人工产品，但这一真正的发展和广泛应用于猪业的养猪业。在20世纪末世界范围内接近50%的母猪都是通过人工授精受孕的,且这个比例还在逐年上升。在一些欧洲国家,如比利时、意大利、荷兰、挪威和西班牙,超过80%的母猪是人工授精,在北美(美国、加拿大和墨西哥)和巴西的大型农场这个比例已经接近75%。目前,世界上每年大约有2500万头次猪进行人工授精。其中,超过99%的授精使用的是储存在15℃~20℃下,最多保存3d的液态冷藏精液。发情期输精2~3次,每次超过25亿精子,将80~100mL的大量精液输入到子宫颈内,受孕率达80%~90%,与自然交配的产仔率和产仔数相当,甚至更高。此外,近1%的授精使用的是剂量在50亿~60亿精子的冷冻、解冻精液,不仅每次输精需要高剂量精子,而且受孕率也低于冷藏精液。在最好的繁育管理条件下也只有大约70%受孕率。猪冷冻精液和性别控制精液正在试验推广中,而以精子载体的转基因(SMGT)、精子胶囊和精子冻干技术将在未来几年内得到发展。这些技术被养猪业接受和采用的速度取决于他们在应用中的效率。由于每次需要大量的精子,现今子宫颈内授精方式在实现效率上受到限制。在一些这类新技术中,比如以性别分离精子为例,在分选后可用的精子非常少。因此,有效的商业应用需要的输精方式,应该能够在输入低精子数量情况下获得正常的繁殖率。1精子有效供给的量子宫颈内授精包括很大数量的精子(约25亿)输进子宫颈后部的皱褶。大多数的母猪在输精时和以后表现出精液逆流。因而,大约30%~40%输入子宫颈管的精子,在授精后1h内从管中流出。同时,超过90%的精子在授精后2~3h内被母猪的生殖系统-子宫颈、子宫输-卵管连接部、输卵管壶峡连接部筛选排斥。这种大量的流失限制了能够到达子宫输卵管连接处的精子数。向成年母猪授精30亿冷藏精子,只有大约10万成功的达到了子宫输卵管连接处,大约1000个精子到达了输卵管峡部的精子储存库。此外,在精子质量差时损失更为严重,比如冷冻-解冻精子。实际上,在输卵管中有效冷冻-解冻精子的数量一般比冷藏精子低十倍。因此,将精液输到子宫颈后更深部位能够允许更多的精子到达子宫输卵管连接部是更合理的,甚至与子宫颈内授精相比使用更少的精子。2将精子直接加入脏器中,确保产仔率有效的授精方式是保证在尽可能少的精子输入后有足够数量的精子进入输卵管-子宫连接部,保证正常的产仔率与产仔数。因此,要从精子液态保存精液和冷冻精液人工授精,探讨授精方式的实用性。2.1因需而进的精子密度的确定冷藏精液输精效果令人满意,但每次需要大量精子。这就降低了良种的公猪生产的精液的效率和利用。而且,当精液的数量有限而大量的母猪需要授精时,精液来源可能出现困难。因此,养猪者对于在不降低繁殖率的同时减少每次输精需要的精子数量很感兴趣。为实现目前常规的子宫颈内授精满意的产仔率和胎产仔数,要求一次输精剂量超过25亿个精子。而当子宫颈授精数量每次低于25亿个精子时,产仔率和胎仔数不能令人满意。因此,选择的合适授精方式是为了实现减少每次输精的精子数。最近提出2项新的不同授精方式,即子宫颈后授精和子宫深部授精技术,这2种方式都包括把精液直接输入子宫内。子宫颈后授精是将精液输到子宫体,而子宫深部授精是将输到子宫角的近端1/3处。2.1.1精子需使用在精子患者中的数量子宫颈后授精,使用的是一个细的和半软的输精装置通过一个事先插入子宫颈皱褶的常规导尿管。因为特殊的输精装置比常规输尿管长15~20cm,它可以通过子宫颈皱褶进入子宫体。Waston&Behan(2002)在英国每次使用10亿精子通过子宫颈后授精技术给3240只经产母猪输精,产仔率为88.7%,胎仔数为12.1只,与子宫颈内授精的产仔率91.3%,胎仔数12.5个相比无显著差异。然而,Roberts&Bilkei(2005)在匈牙利和克罗地亚对1783只经产母猪分别使用10亿精子子宫颈后授精和30亿精子子宫颈内授精,尽管2者在产仔率上相似,但子宫颈后授精的母猪胎产数却明显少(前者10.2只,后者12.3只),这些结果与Rozeboom等(2004)于美国研究报道一致。当尝试更少输精数量时,即每次输精5亿精子,产仔率和胎仔数更低。因此,子宫颈后授精方式直接把每次10亿精子输入子宫体可获得正常的产仔率,但胎产仔数可能下降。使用子宫颈后授精可以减少精子数量而不会减少产仔率的2个主要原因是半软授精装置越过子宫颈皱褶,同时精液逆流减少20%。然而,每胎产仔数减少的原因还不清楚。而Roberts&Bilkei(2005)认为是非正规的授精造成的,因为缺少对使用子宫颈后授精装置操作的训练。一些其他原因,如老化的精子,操作不当或者输精与排卵时间间隔,在使用较少的精子数量时都会导致繁殖率下降。此外,在当前生产条件下使用子宫颈后授精,10亿输精数量似乎不能达到正常繁殖率。因此,为了获得高繁殖率,应该考虑增加输精数量。2.1.2规过胎产仔数子宫深部授精方式包括通过一个事先插入子宫颈皱褶用作向导的常规授精输尿管,把一个柔韧纤细的装置导入一个子宫角。子宫深部授精装置能够顺着子宫腔前进,使精液容易输入子宫角近端1/3处。Vazquez等(2001)在西班牙对329只经产母猪使用子宫深部授精(1.5亿精子/次)一次、2次或3次以及子宫颈内授精(30亿精子/次),产仔率为83.3%~87.3%,胎产仔数在9.2~10.4个,虽然2种授精方式间无统计差异,子宫深部授精的胎仔数总是最低的。Day等(2003)在美国对105只经产母猪分别采用2次子宫深部授精1.5亿精子或者子宫颈内授精30亿精子,虽然在产仔率(子宫深部授精83%,子宫颈内授精90%)上没有差异,但子宫深部授精的母猪每胎产子猪数较少(前者10.5只,后者12.9只)。从2个研究中结果可以推测,胎仔数的下降可以通过增加每次授精的精子数克服。与子宫颈内授精相比,子宫颈后授精和子宫深部授精方式可以减少每次对冷藏精子数目的需要。达到子宫颈内授精(30亿精子每次)的受精效果,可以期待由每次输精1~1.5亿(子宫颈后授精)或6亿(子宫深部授精)得到。因此,这2种方式都可以被视为接近在生产条件下使用冷藏精液的实用、有效的授精方式。特别是在精源有限或者高质量的种公猪的精液需要被尽可能有效的使用情况下。但该技术中将输精管准确的插入到子宫及子宫深部需要培训和练习。授精后阴门出现的血液很可能与外伤有关,应该是对装置的不正确操作所致。同时,利用该技术给初配猪授精要慎重,因为使装置通过小猪子宫颈比较困难。2.2不同的授精方式对子犯精子的应用在大型种公猪场使用冷冻精液人工授精,充分利用优秀种公猪的遗传潜力很有必要。然而,冷冻精液在世界范围内的人工授精中应用不到1%。冷冻解冻精液子宫颈内授精获得繁殖率低于冷藏精液,同时每次授精需要的大量精子,这就限制了冷冻精液在养猪业世界范围内的商业化应用。目前,猪冻精人工授精一般每次采用50~60亿精子的大剂量子宫颈内授精,但受孕率与产仔率都很低,这可能与子宫颈内授精方式的低效有关。同时,冷冻-解冻精液品质下降,冷冻-解冻精子通过子宫颈褶,进入子宫到达子宫输卵管连接处更加困难,导致在输卵管峡部不能储存足够的精子。当然,使用冷冻-解冻精子与液态保存精子相比,胚胎透明带附着的精子数量大约少10倍左右,输精的精子数量前者比后者要多2倍。因此,冷冻-解冻精子的有效应用需要在授精方式上改进。无论子宫颈后授精还是子宫深部授精都应该是改善冷冻-解冻精子受精产仔效果的比较适合的授精方式。这2种授精方式应能抵消冷冻-解冻精子在商业农场中常规应用的限制因素,即每次需要的大量精子和得到的低受精率。此外,这2种授精方式适合商业化应用,尤其是农户使用。在西班牙、澳大利亚和瑞典完成的不同的报告证明了这一点。Bolarin等(2006)研究了自发排卵母猪(n=407),强调每次授精只使用10亿冷冻-解冻精子的效果。当接近排卵时间(超声波检查)时采取子宫深部授精,获得超过80%的产仔率和胎产仔数也超过10只。并强调重视发情排卵时间确定在更精确时间授精以得到最高受精率的重要性。此外,Wongtawan等(2006)建议使用冷冻-解冻精子子宫深部授精应该在自发排卵前4~8h进行。在人工授精方式中冷冻-解冻精子的受精成功率取决于人工授精的排卵的时间间隔。目前,预测排卵时间的方法受限于平均发情持续时间的评估,因为自发排卵在发情后发情期的3分之二时发生。因此,建议常规繁育管理的养猪户使用冻精授精时增加子宫深部授精每次剂量的冷冻-解冻精子数。总之,子宫深部授精方式有使用最少10~20亿冷冻-解冻精子实现高受精率的潜力。2.3精子在脏器外科手术中的应用通过流式细胞仪进行X、Y精子分离技术是基于DNA含量的相对差可以鉴别含X或Y染色体的精子,并且受精前确定后代的性别。精子由荧光染料(Hoechst33342)染色,染料穿入精子头部细胞膜与DNA结合。因为Y染色体比较大的X染色体偏小并携带更少的DNA,精细胞在激光下曝光表现出2种不同的荧光强度并可通过流式细胞仪测量。目前,借助高速分离系统,每分钟能鉴别超过2万个精细胞,1h内超过1500万精子能够被性别分离,超过85%的纯度。因此,每24h能得到3.6亿性别分离的精子。性控精子通过外科手术授精生产了第一只小猪。给126只母猪(n=126)子宫深部授精每次至少5000万精子,产仔率超过75%和胎仔数9只。Vazquez等(2003)报告激素处理46只经产母猪,一次授精最少5000到7000万新鲜性控精子,产仔率达到40%。但每次授精所需精子数量还是太大,以致不能认为子宫深部授精对性控精液是一种有效的授精方式。最近,研究显示最少1000万冷藏精子通过外科手术植入子宫输卵管结合部即可得到高的受孕率(89%)。虽然,手术卫生严格,但外科剖腹手术不被认为是养猪场母猪授精的实用方式,一种可选择的方法是腹腔镜法。比起剖腹手术把精液直接输入子宫,腹腔镜法是一种创伤较小的手术,并且可在大的养殖场培训推广。在意大利完成的一项近期试验,Fantinati等(2005)通过腹腔镜把精子输入接近子宫输卵管连接处,达到高受精率所需的冷藏精子数量可以减少至每个子宫角500万个精子。这种腹腔镜技术已经被证明可用于性控精液输精。最近报道,使用腹腔镜法每个子宫角最少30万个性别分离精子,受孕率可达到80%。此外,近来的研究也证明必须在排卵前输精才可获得最高的繁殖率,因为性别分离精子在雌