大孔吸附树脂精制岗梅注射液工艺研究

大孔吸附树脂精制岗梅注射液工艺研究

梅叶是冬青科植物的一种古老植物，属于秋海棠。它有干燥的根系和根茎，苦味甘甜清新。具有清热解毒、止咳、促进吞咽、消除充血和缓解疼痛的功效。它可以用来治疗感冒、咳嗽、发烧、津伤、咽喉疼痛、跌倒和疼痛等疾病。药效学研究表明岗梅有抗流感病毒、抗炎、抗菌、抗肿瘤作用及抗心肌缺血等作用。主要有效成分为皂苷类,ilexosideXXIX是岗梅中含量较大的三萜皂苷类成分。大孔吸附树脂在分离纯化天然产物中有广泛的应用,AB-8型和D101型大孔吸附树脂在分离皂苷类成分时具有较大的优势[8,9,10,11,12,13,14]。本试验以岗梅总皂苷结合ilexosideXXIX为指标优化岗梅药液精制工艺参数。1梅叶青氨酸酯类,见204-n,5d-214SHIMADZU高效液相色谱仪(日本岛津公司),SEDEX75蒸发光散射检测器(法国SEDEX公司),N2000色谱工作站(浙江大学),AB204-N型万分之一电子分析天平,十万分之一电子分析天平(SartoriusCP225D)。岗梅采集于广东省从化森林公园,经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波教授鉴定为梅叶冬青Ilexasprella(Hook.etArn.)Champ.exBenth的根及根茎。对照品ilexosideXXIX纯度为98.9%(暨南大学天然药物研究所张晓琦副教授提供)。乙腈、甲酸均为色谱纯,水为超纯水。2方法和结果2.1提取液的制备取岗梅药材粗粉905g,加入8倍量的60%乙醇,加热回流1.5h,滤过,滤渣再加入6倍量的60%乙醇,加热回流1h,滤过,合并滤液,测定体积,得提取液11020mL,备用。2.2岗梅总糖含量测定2.2.1供试品溶液的制备量取岗梅药液适量,蒸干,残渣用5mL水溶解,上已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱(13mm×150mm),用蒸馏水水洗至澄清,再用95%乙醇洗脱,收集醇洗液至100mL量瓶刻度,摇匀,即得供试品溶液。2.2.2岗梅总皂苷的测定在400～700nm波长处扫描,IlexosideXXIX与岗梅提取液的紫外吸收曲线基本一致,最大吸收波长为541nm,故采用ilexosideXXIX标定岗梅总皂苷。IlexosideXXIX与岗梅提取液的紫外吸收曲线见图1。2.2.3冰醋酸法精密吸取供试液0.5mL,置试管中,水浴蒸干,加5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL,摇匀,在60℃水浴中加热20min,取出,冷水冷却10min,加冰醋酸至5mL,摇匀,以相应试剂作空白对照,541nm处测定吸光度。2.2.4总皂苷的测定精密称取岗梅对照品ilexosideXXIX5.43mg,置5mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,得对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.14、0.18mL于试管中,照2.2.3项测定总皂苷的含量。以对照品质量浓度C(mg/mL)对吸光度A进行线性回归,回归方程为:A=28.383C-0.053,r2=0.9995,岗梅对照品溶液质量浓度C在4.3～39.1μg/mL内呈良好的线性关系。2.3一般肥皂测定的研究2.3.1仪器精密度试验精密吸取0.1mLilexosideXXIX对照品溶液于试管中,照2.2.3项测定,重复测定吸光度6次,计算结果得RSD为0.63%,表明仪器精密度良好。2.3.2重复实验精密量取岗梅供试液0.5mL各5份,照2.2.3项下方法测定总皂苷含量,结果得RSD为1.49%,表明方法重现性良好。2.3.3显色后温度的影响精密量取岗梅供试液0.5mL各6份,照2.2.3项显色,显色后室温放置,分别在0、15min、30min、1h、2h、4h后测定吸收值,实验结果显示该方法经过时间的延长,显色效果不稳定,显色结束到测定吸收值的时间宜控制在30min内。2.3.4加标回收率和rsd精密量取岗梅供试液0.5mL各6份,分别精密加入对照品2.5mg,水浴蒸干,残渣加入95%乙醇溶解并定容于50mL量瓶中,照2.2.3项测定,结果测得回收率为95.92%,RSD为2.14%。2.4ilexodisis吹口印数x2.4.1流动相的测定经优化色谱条件,确定以PhenomenexBDSC18柱(250mm×4.6mm,5μm)为固定相,以乙腈-0.2%甲酸为流动相,按表1梯度洗脱。漂移管温度:40℃,载气(氮气)压力:2.5bar,体积流量:1mL/min,柱温:28℃,进样量:10μL。在以上色谱条件下测定,谱图见图2,3。2.4.2ilexosica—ilexosideXXIX标准曲线的制备分别吸取对照品溶液1、2、4、10、25、30μL注入液相色谱仪,测定峰面积,以进样质量的自然对数为横坐标,峰面积的自然对数为纵坐标,进行线性回归,得回归方程为Y=1.3535X+4.7495,r=0.9998,表明ilexosideXXIX进样质量在0.984～29.52μg范围内的自然对数值与峰面积的自然对数值成良好线性关系。2.5ilexol系统计算法的研究2.5.1加样回收试验精密吸取对照品溶液10μL,在上述色谱条件下,重复注入液相色谱仪6次,测定峰面积,结果RSD为1.02%。表明仪器精密性良好。2.5.2iloposicaxix含量的测定精密量取岗梅药液50.0mL各5份,分别水浴蒸干,残渣加入甲醇溶解并定容于10mL量瓶中,精密注入高效液相色谱仪各10μL,测定峰面积,计算ilexosideXXIX的平均含量,RSD为1.14%。表明方法重复性良好。2.5.3高效液相色谱法精密量取岗梅药液50.0mL各6份,分别水浴蒸干,残渣加入甲醇溶解并定容于10mL量瓶中,精密注入高效液相色谱仪各10μL,分别在0、2、4、8、12、24h进样,测定峰面积,RSD为1.37%。结果表明供试品溶液在24h内保持稳定。2.5.4iloposica预测il提高回收率精密量取岗梅药液10.0mL各6份,分别精密加入对照品5.0mg,水浴蒸干,残渣加入甲醇溶解并定容于25mL量瓶中,精密注入高效液相色谱仪各10μL,测定ilexosideXXIX含量,结果其平均回收率为99.91%,RSD为1.21%。2.6对精细工艺参数的研究和优化2.6.1树脂总皂苷及ilexosicammis含量测定及评估量取上述岗梅醇提取液61.0mL(相当于生药量5g)3份,水浴蒸干,分别加水溶解至25mL,上已预处理的AB-8、D101、F型大孔吸附树脂柱(13mm×150mm),体积流量为1.0mL/min,收集过柱液;用100mL蒸馏水洗,收集水洗液,与过柱液合并;再用95%乙醇洗脱,收集醇洗液至100mL量瓶刻度。将醇洗脱后的树脂先后用2%NaOH洗至澄清、蒸馏水洗至pH值为7,再用95%乙醇洗至澄清,置于烘箱中,烘干,称定树脂质量。精密量取提取液、过柱及水洗液供试液、醇洗液供试液适量,分别按2.2.3项和2.4.1项下进行测定并计算总皂苷和ilexosideXXIX的含量,根据比吸附量及解析率对3种树脂进行筛选。比吸附量:A=(M上-M水)/M树脂;解析率:S=M洗脱/M吸附×100%。式中M上为上柱液中总皂苷或iIlexosideXXIX总含量(g),M水为过柱液、水洗液中总皂苷或iIlexosideXXIX总含量(g),M树脂为树脂质量(g),M洗脱为醇洗液中总皂苷或iIlexosideXXIX总含量(g),M吸附为上柱液中总皂苷或iIlexosideXXIX总含量减去过柱水洗液中总皂苷或iIlexosideXX-IX总含量(g)。实验结果如表2,AB-8的比吸附量和解析率最高,F型树脂的比吸附量与解析率均最小。综合考虑比吸附量与解析率,AB-8大孔吸附树脂适合用于岗梅总皂苷的精制。2.6.2动态吸附剂测定量取岗梅提取液243.5mL(相当于生药量20g),减压回收至无醇味,加水稀释至100mL即得上柱液,过已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱(13mm×150mm),按顺序收集过柱液,每2.5mL为1份,共收集34管。将34管过柱及水洗液再分别经AB-8大孔吸附树脂纯化,收集醇洗液,分别按2.2.3项和2.4.1项下进行测定并计算总皂苷和iIlexosideXXIX的浓度。所得动态吸附曲线见图4,第26管总皂苷质量浓度为0.45mg/mL,已超过上柱液的5%。而第34管时iIlexosideXXIX未吸附率仅为3.91%,仍未超过上柱液的5%。说明以iIlexosideXXIX作为指标考察树脂泄漏点有一定的缺陷,不足以全面反映总皂苷的信息,总皂苷对最大上样量的反应更为敏感,故最大上样量以总皂苷结果计。树脂干质量为4.04g,以5%即得泄漏点计,其最大上样量为3.09g生药/g干树脂;以总皂苷计,其最大上样量为119.43mg总皂苷/g干树脂。2.6.3洗脱溶剂测定按照确定的最大上样量,将岗梅上柱液过已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱,蒸馏水洗至澄清,再依次以20%、40%、60%、80%、95%乙醇分别洗脱4倍柱体积,收集醇洗液,分别按2.2.3项和2.4.1项下进行测定并计算总皂苷和iIlexosideXXIX的含量。结果如表3显示,60%乙醇可累积洗脱下几乎100%的iIlexosideXXIX和约89%的皂苷,而80%乙醇可累积洗脱下约98.5%的皂苷,接近洗脱完全。综合考虑工艺成本与洗脱效率,选择80%乙醇为岗梅的大孔吸附树脂精制工艺的洗脱溶媒。2.6.4洗脱溶剂用量的确定按照确定的最大上样量及洗脱溶媒浓度,将岗梅上柱液过已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱,蒸馏水洗至澄清,用80%乙醇洗脱,每1倍柱体积分别收集,共收集6倍柱体积,备用。分别按2.2.3项和2.4.1项下进行测定并计算总皂苷和iIlexosideXXIX的含量。结果见表4显示,3倍柱体积的80%乙醇能将iIlexosideXXIX洗脱完全,也能洗脱97%的总皂苷,而更多洗脱溶媒仅能增加少量的总皂苷;综合考虑总皂苷保留率和生产成本,确定洗脱溶媒用量为3倍柱体积。2.6.5皂苷和iiloposicaxx含量的测定根据树脂精制工艺确定的参数进行重复试验,取岗梅上柱液适量,平行2份,过已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱(3.5cm×20.8cm),体积流量为1mL/min,收集过柱液,用蒸馏水洗,洗至澄清,收集水洗液,再用80%乙醇洗脱,收集3倍柱体积,备用。分别按2.2.3项和2.4.1项下进行测定并计算总皂苷和iIlexosideXXIX的含量。结果见表5,6所示,经过AB-8大孔吸附树脂纯化后,总皂苷和iIlexosideXXIX含量保留率均达80%以上,精制后固形物中总皂苷和iIlexosideXXIX分别达到87.03%及10.83%。3预处理条件的确定3.1本实验以岗梅药材中特征性成分iIlexosideXXIX标定岗梅总皂苷,以岗梅总皂苷和iIlexosideXXIX保留率为指标,筛选树脂种类、最大上样量、洗脱溶媒浓度和洗脱用量等大孔吸附树脂精制工艺的关键参数,并对精制前后HPLC特征图谱进行比较,结果更为可靠。本实验还筛选了药液上柱前的预处理方式,包括离心工艺及上样浓度对岗梅总皂苷和iIlexosideXXIX保留率的影响。结果显示上柱液的离心工艺导致总皂苷损失较大,不宜采用;结合生产效率和工艺连续性,将上柱液浓度确定为0.2g生药/mL。3.2经过实验研究,确定岗梅药液