体内药物分析

体内药物分析Biopharmaceuticalanalysis中山大学药学院徐月红第一节体内药物分析概述一、体内药物分析的定义研究生物机体中药物及其代谢物和内源性性物质的质和量变化规律的分析方法学。二、体内药物分析的意义（一）在新药评价和开发中的意义

1．全面质量控制

2．新药报批

3．为设计新药提供信息

①从代谢产物中开发新药保泰松→羟基保泰松（作用强、副作用小）非那西丁→扑热息痛

②前药设计

③新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决（二）临床合理用药中的意义

1．血药浓度与药理作用2.影响血药浓度的因素（1）机体因素

a．生理因素年龄、性别、生理状况

b．病理因素

c．遗传因素（2）药物因素

a．剂型因素（生物利用度问题）

b．药物合并使用（酶抑、酶促）

c．时间因素（三）药物中毒解救的意义（四）兴奋剂检测的意义三、体内药物分析的对象3．从样品的来源分1．从分析物分母体药物代谢物内源性物质2．从生物样品种类分均匀样品非均匀样品人体实验动物四、体内药物分析的任务（一）方法学的研究（二）治疗药物监测

TDM，therapeuticalDrugMonitoring1．定义2．哪些药物需进行体内血药浓度监测①有效血药浓度范围窄，稍高毒性大，稍低无疗效②剂量小，毒性大的药物③个体差异大，剂量难以控制④药物毒性反应与疾病症状相似⑤多种药物合并应用，有中毒危险⑥胃肠道、肝脏、肾脏疾病⑦呈非线性动力学的药物⑧判断患者用药的依从性（三）药代动力学的研究（四）代谢分型的应用（五）内源性物质测定

五、体内药物分析的特点1．干扰杂质多2．样品浓度低3．取样量少4．工作量大5．时间短6．有一定设备六、体内药物分析方法1.光谱分析法：比色法、紫外法、荧光和原子吸收分光光度法2.色谱分析法：TLC、TLCS、GC、HPLC、HPCE3.免疫分析法：IA4.电化学分析法灵敏度专属性光谱法++刚开始应用较多，双波长，导数色谱法++++++HPLCGC免疫法++++++免疫交叉反应，重现性七、体内药物分析的发展1．国外发展概况60年代初 发现药效与血药浓度关系70年代 体内药物分析方法建立80年代~至今 发展迅猛，新仪器不断涌现书籍出版《DrugLevelMonitoring》 1980《TherapeuticalDrugMonitoring》 1981《TextbookofBiopharmaceuticAnalysis》 19812．国内情况

80年代初，药物分析工作者倡导，1980年版《药物分析》教材中纳入部分内容，第二、三版增加体内药物分析一章。第四版、第五版取消，各学校开设体内药物分析课程。

80年代开始在医院进行临床药学工作，主要测定药物浓度。有关书籍吴如金《体内药物分析》 人卫版 1984陆明廉《血药浓度测定与临床应用》上海科技 1986陈刚《治疗药物监测理论与实践》人民军医 1988吴莱文《治疗药物监测》 人卫版 1989曾经泽《生物药物分析》 北京大学出版社1998姚彤炜《体内药物分析》 浙大 2001张君仁《体内药物分析》 化学工业出版社 20023．学科前沿游离药物浓度测定直接进样方法研究代谢物测定对映体分析第二节体内药物分析的研究现状一、临床药理学（ClinicalPharmacology)

体液中药物浓度的测定二、临床药学药物代谢动力学

TDM三、新药体内研究《药品注册管理办法》化学药品：22、复方制剂中多种成份药效、毒性、药代动力学相互影响的试验资料及文献资料。27、非临床药代动力学试验资料及文献资料。中药：28、动物药代动力学试验资料及文献资料。四、治疗药物检测利用现代的分析测试技术来测定血液或其他体液中的药物及其代谢物的浓度，并运用药代动力学原理，实施给药方案个体化以提高药物疗效，避免或降低药物的毒副作用，从而实现真正意义上的合理用药。对象：血清、血浆、全血五、药物代谢产物的研究目的：了解药物在体内的命运及相互作用，保证临床用药安全有效研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新药研究药物相互作用机制有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰途径：第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极性增加，水溶性增强第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结合过程通常使药物灭活。药物代谢的研究事项：1．样品的保存样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。2．分析方法选择光谱法色谱法免疫法3．样品的提取、分离法代谢物极性大、水溶性强，pH缓冲系统分开尿液中药物多以结合型存在，要进行水解（酸水解、酶水解，溶剂解）六、内源性活性化合物的测定

P417表19－1体内内源性化合物与疾病的关系第三节体内药物分析的研究热点一、游离型血药浓度测定方法学研究二、体内微量元素的测定研究三、体内对映体药物的研究四、中药成分代谢分析五、不经预处理的直接进样测定技术研究六、微透析技术的研究七、在体药物检测技术的研究第四节体内药物存在的状态与

体内药物分析的关系一、药物的体内变化吸收→分布→代谢→排泄ADME过程发生两种变化物理变化可逆变化化学变化结构和数量发生变化二、药物与血浆蛋白的结合1．游离型药物与结合型药物（非特异性的结合）①在血浆、组织中均存在游离型和结合型的药物②尿液中含微量P，血浆中含大量P，唾液中P为血浆1/10③与药物结合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂蛋白弱酸性药物主要与白蛋白结合弱碱性药物与白蛋白、a1-酸性糖蛋白结合④药物与蛋白质的结合通过共价键（氢键，离子间静电力等）2．血浆蛋白结合率Df+PDbK=解离常数血浆蛋白结合率：Β==[P]·[Df]DbDbDb+Df11+K/np+Df/np结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞争蛋白是药物相互作用类型之一。由此可见，K、np是影响β的重要因素

np↓β↓K↓β↑

药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。3．血浆蛋白结合的测定平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、光谱法等。（1）平衡透析法

①原理

②计算β=×100%=Ct-Cf/Ct×100%袋内-袋外袋内药物③注意事项a.蛋白质溶液新鲜血浆pH7.4，至少三个浓度测定b.缓冲液0.13mol/L磷酸盐缓冲液，因为Na3PO4抑制酸性药物与蛋白质结合c.温度与平衡时间37℃16~48h注意防腐剂加入，药物的分解d.透析袋渗漏检测3%三氯醋酸e.搅拌保持动态平衡④影响因素a.药物膜上吸附b.Donnan效应由于电荷的影响，可造成平衡时半透膜两侧游离药浓不同，donnan效应，加入中性盐可消除。c.空白值增加d.缓冲液体积变化，水分进入血浆游离药浓↑此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用（2）超滤法原理计算注意事项

a．装置50μl→5ml，选择不同型号超滤膜，保湿。

b．速度与时间3000~10000r/min5~15minc．温度37℃，25℃，4℃影响因素

a．膜吸附

b．超滤液的体积超滤液/总体积≈0.3~0.6

c．超滤膜温度三、药物与血浆蛋白结合对体内药物分析的影响1．血浆不同对体内药物分析的影响2．平衡状态不同对体内药物分析的影响3．平衡状态受破坏对体内药物分析的影响4．游离与结合同时出现时对体内药物分析的影响四、药物代谢1．研究药物代谢的意义了解药物在体内的命运及相互作用，保证临床用药安全有效研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新药研究药物相互作用机制有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰2．药物代谢的途径第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极性增加，水溶性增强第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结合过程通常使药物灭活。氧化反应还原反应水解反应结合反应

a．葡萄糖醛酸结合

b．硫酸酯化

c．谷胱甘肽缀合

d．乙酰化结合

e．氨基酸结合五、药物代谢与体内药物分析的关系1．样品的保存样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。2．分析方法选择光谱法色谱法免疫法3．样品的提取、分离法代谢物极性大、水溶性强，pH缓冲系统分开尿液中药物多以结合型存在，要进行水解（酸水解、酶水解，溶剂解）第五节生物样品的预处理一、生物样品的采集与贮藏体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。（一）样品的采集1．血样血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。血细胞血浆（plasma）血小板血清（serum）血细胞测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓抗凝自然全血血液2．尿样目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分离3．唾液唾液中药浓与血浓相关性收集方法离心收集（二）样品的贮藏1．血样（血浆、血清）及时分离→冷藏，-70℃加入稳定剂NaF2．尿样

①尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，4℃保存

②加入防腐剂a．1%甲苯b．饱和氯仿c．pH改变3．唾液：同血样二、生物样品的预处理（一）预处理的目的

①存在形式的多样性游离结合代谢物

②浓度低，杂质多（分离浓缩）

③出现浑浊和沉淀

④与试剂起反应

⑤影响色谱柱寿命（二）处理方法选择的一般原则1．药物理化性质

pKa亲脂性挥发性溶解度光谱特征稳定性2．浓度范围灵敏的方法3．测定的目的定性定量母体代谢4．生物样品的种类5．样品处理与分析方法的选择

①专一性②灵敏性（三）生物样品去蛋白处理1．加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀剂三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而↓，pH低于等电点3．组织酶消化法加入酶使蛋白质水解优点：①平衡条件下进行，可避免反应和降解

②可改善对蛋白结合率强的药物的回收率

③不产生乳化4．其他加热超滤（四）生物样品缀合物水解1．酸水解2．酶水解

β-葡萄糖醛酸苷酶芳基硫酸酯酶混合酶

pH4.5-7.037℃3．溶剂解某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中（五）生物样品的萃取1．液-液萃取（1）优点：①与杂质分离②简便

③浓集④提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取，>70%重现性（3）影响提取率的因素

①pH碱性药物在碱性pH酸性酸性pH②提取溶剂相似相溶原理沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应

③离子强度加入中性盐增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取（4）离子对提取对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取①原理②应用阴离子：COOH+SO3H-

反离子四丁基铵阳离子：NH2+

反离子烷基或芳基磺酸盐（5）提取技术一般在试管中进行有机相与水相比1:1或2:1（6）乳化问题措施

①轻缓振摇

②含有分散度大或不溶物应过滤掉

③避免在高pH条件下，从水中提取药物

④避免使用易发生乳化的溶剂

⑤萃取剂水中加入少量NaCl破孔方法

①机械法

②加入少量高级脂肪醇改变表面张力

③改善混合溶剂比例，增加分散相分数（7）药物的吸附①玻璃容器吸附1%三甲一氯硅烷10%二甲二氯硅烷②血浆2．液固萃取固相萃取[solidphaseextractionSPE]针管式抽空减压加压过滤（1）固相萃取步骤①固相选择样品1ml1ml规格固相1~25ml3ml规格固相②固相处理反相C18

固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化

6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态③上样④分离用适当的弱溶剂洗涤洗去杂质，通N2干燥固相⑤洗脱待测物改变pH或极性（2）影响固相萃取的因素（1）流速流速快，按触不充分，样品流失回收率低柱处理5~10ml·min-1

洗脱0.2~1ml·min-1（〈300mg〉2~5ml·min-1（>300mg）（2）装样过载突破性试验已知浓度样品液

①小体积上柱→洗脱回收百分率

②加大体积→洗脱回收百分率

③绘图当回收率下降时为过载（六）生物样品的组分浓集（七）衍生化处理

GC衍生化

HPLC衍生化第六节体内药物分析方法的建立与评价一、分析方法灵敏度专属性光谱法++刚开始应用较多双波长，导数色谱法++++++HPLCGC免疫法++++++疫交叉反应，重现性根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的二、分析方法的设计依据方法的建立原始方法改进→创新创立方法1．做好文献总结2．充分了解药物特征及体内状况

pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况3．明确测定目的、要求目的4．结合实验室条件

设备条件

预处理方法药浓监测药代动力学研究母体药物和代谢物三、分析方法的建立1．纯品进行测定确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T）2．空白样品测定确定空白样品是否有干扰3．以水代替空白样品，加标准液后测定了解提取率、检测浓度确定萃取条件、pH、挥发浓缩等4．空白样品加入标准液测定标准曲线建立

回归方程

回收率5．实验样品测定

四、分析方法的评价可行性和可靠性

1．准确度

accuracy

测定结果与真实性的差异用回收率表示

①接近100%②相对恒定①绝对回收率也称萃取回收率、提取回收率测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液=绝对回收率考虑3个浓度（高、中、低）

分布在标准曲线成上、中、下一般要求绝对回收率在≥70%一般方法 HPLC内标内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值<10%②相对回收率方法回收率药物系列浓度+血样→标准曲线取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值<15%，定量限<20%注意问题：

a．加入药量与实际测定值相近

b．加入物与实际存在状