生物酶解乌骨鸡工艺研究

生物酶解乌骨鸡工艺研究

乌艾乌沙的作用是补充气血、调经和停止。临床上，他主要从事气和气两虚、身体瘦弱、腰膝软、不调月经、崩塌和逃税。这是传统的中医之一。乌骨鸡是乌鸡白凤丸的主要原料。由于乌骨鸡的传统工艺为蒸罐、干燥、粉碎,工时长。为了探索适合工业化生产的新工艺,本研究提出了乌骨鸡酶解后入药的工艺路线,并通过药理实验,验证了乌骨鸡酶解后入药的合理性。1工艺部分1.1材料、试剂和机器(1)原材料乌骨鸡,冷冻鲜品。(2)培养基和试剂胰蛋白酶(trypsin)1∶250,Sino-AmericanBiotec(Be2189)25g/瓶;胰酶(批号:050107)1∶125,北京双旋微生物培养基制品厂;木瓜酶(批号:040219)98000U,北京双旋微生物培养基制品厂;中性酶(批号:050120)60000U,北京双旋微生物培养基制品厂。(3)其他试剂茚三酮、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠均为分析纯;蒸馏水。(4)u3000分光光度计UnicoWFZ(上海)UV-2000型紫外/可见分光光度计;800B型离心机,上海安亭科学仪器厂;BS110S型电子天平,北京赛多利斯仪器有限公司;pHS-25型酸度计,上海伟业仪器厂。1.2方法1.2.1测定波长的确定对照品丙氨酸于200～700nm处全波长扫描,确定567nm为测定波长(见图1)。供试品溶液在可见光区567nm处也有最大吸收(见图2)。1.2.2标准曲线绘制精密称取丙氨酸对照品2.68mg于10mL量瓶中,加入蒸馏水稀释至刻度,分别精密吸取对照品溶液0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL于10mL量瓶中,依次加入1.5、1.4、1.3、1.2、1.1mL蒸馏水、0.5mL人工肠液、0.1mL茚三酮显色剂,混匀,沸水浴中加热15min,流水冷却至室温后再加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。依上法平行操作,以不加对照品溶液所制得的溶液为空白,在567nm波长处测定吸光度。以对照品浓度(g/L)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线,得线性方程:Y=35.448X-0.0738(r=0.9996)。取1.0g乌鸡熟骨肉粗粉于100mL具塞圆底烧瓶中,分别加入20mL人工肠液,密闭,于50℃恒温水浴作用30min,加入酶,2h后将酶解液置85℃恒温水浴灭活15min,吸取2mL酶解液,5μm膜滤,冷却至室温后,备用。代入标准曲线方程计算酶解物浓度(X值),按下列公式计算丙氨酸含量(mg/g)。丙氨酸含量(mg/g)=(酶解物含量×稀释倍数)/样品量×1001.2.3酶反应条件试验1.2.3.复合酶对测定患者的影响取1.0g乌鸡熟骨肉粗粉于100mL具塞圆底烧瓶中,分别加入20mL人工肠液,密闭,于50℃恒温水浴作用30min,分别加入10000U的木瓜酶、中性蛋白酶(简称中性酶)、胰酶、胰酶加胆酸钠、木瓜酶加中性蛋白酶(简称复合酶),依上述方法酶解,测定,计算含量,结果见图3。通过直观分析,胰酶加胆酸后酶解效果虽然较好,但却增加了酶解液的苦味。所以选择中性蛋白酶酶解。1.2.3.2.固液体比研究由数据可知固液比为1∶20和1∶30时,酶解较充分,并且数值比较接近,从生产与经济角度考虑,选择固液比为1∶20(见图4)。1.2.3.3.酶分解时间的研究随着酶解时间延长酶解越充分,3～4h较为接近(见图5)。1.2.3.4.最佳ph值的选择结果表明,当pH=8.3时中性蛋白酶的酶解效果最佳(见图6)。1.2.4影响实验结果的因素以温度(℃)、水解时间(h)和酶量(活力单位)为考察因素,选择不同水平,按正交设计L9(34)表安排实验(见表1～3)。计算公式:代入标准曲线方程,得(g/L)=0.5960+0.11893.8321=0.1866(g/L)=0.5960+0.11893.8321=0.1866水解率(％)=0.18661000×0.08×20×10×100=46.65(%)(％)=0.18661000×0.08×20×10×100=46.65(%)由方差分析可知各因素对实验结果均无显著性影响。通过极差分析可知各因素对结果的影响为酶解温度>酶解时间>酶浓度,确定12000U中性酶、50℃、酶解4h为最佳酶解条件。2疗效评估研究结果根据原方主要功效选作相关实验,实验结果摘要如下:2.1小鼠单次致小鼠扭体次数ld50乌鸡白凤丸(酶解)、乌鸡白凤胶囊、乌鸡白凤丸3种制剂预防给药3d可明显减少缩宫素所致小鼠10～20min扭体次数(与空白对照组相比P<0.05,P<0.01);乌鸡白凤丸(酶解)2.4、1.2g/kg乌鸡白凤丸3.6g/kg,可明显缩短小鼠0～10min扭体次数(与空白对照组相比P<0.05,P<0.01);说明此两种制剂起效较快。2.2不同白凤丸对莲子平滑活动度的影响乌鸡白凤丸(酶解)各剂量(1.2、0.6、0.3g/kg)、乌鸡白凤丸0.9g/kg连续给药3d可明显降低大鼠在体子宫平滑肌收缩频率,乌鸡白凤丸(酶解)0.3、0.6g/kg、乌鸡白凤丸0.9g/kg可明显降低子宫平滑肌活动度(与空白对照组相比P<0.05,P<0.01)。使用缩宫素后子宫平滑肌收缩力、张力、收缩频率和活动度均明显增加,乌鸡白凤丸(酶解)0.6g/kg、乌鸡白凤丸0.9g/kg可明显抑制缩宫素对子宫平滑肌的兴奋作用,在各时间点均抑制收缩力和收缩频率的增加,降低子宫活动度(与空白对照组相比P<0.05,P<0.01)。2.3白凤丸单次给药对急性营养成分的作用乌鸡白凤丸(酶解)各剂量(1.2、0.6、0.3g/kg)组可不同程度地改善急性血瘀大鼠各项血液流变学指标,降低全血中、低切黏度,抑制红细胞变形指数的降低,抑制红细胞聚集指数、红细胞压积的升高(与模型组相比P<0.05,P<0.01)。乌鸡白凤丸0.9g/kg抑制急性血瘀大鼠红细胞聚集指数的升高。乌鸡白凤丸0.9g/kg可明显抑制急性血瘀大鼠红细胞压积的升高。2.4鸡白凤丸酶解1.2、0.3g/l对小鼠红细胞数的影响,2.慢性失血大鼠红细胞数、血红蛋白含量明显降低(与空白对照组比较P<0.01)。乌鸡白凤丸酶解1.2、0.6g/kg组,乌鸡白凤丸1.8g/kg组可明显抑制红细胞数的减少(与模型组相比P<0.05,P<0.01)。乌鸡白凤丸酶解0.6g/kg组可明显抑制血红蛋白含量的减少。2.5脑物质中hsb、hb3和5.7.7.7%白砂糖数使用环磷酰胺造模后,模型组大鼠白细胞数、红细胞数、血红蛋白含量明显降低(与空白对照组比较,P<0.05)。治疗后乌鸡白凤丸酶解1.2g/kg组可明显升高白细胞数(与模型组相比P<0.05)。乌鸡白凤丸酶解各剂量(1.2、0.6、0.3g/kg)组、乌鸡白凤丸0.9g/k