现代环境生物技术的特点及应用

.页眉.页脚..现代环境生物技术的特点及在环境工程中的应用摘要:对诱变、原生质体融合及基因技术在环境工程中的研究进展进行了概述;说明了现代生物技术在环境工程上的应用主要集中在构建高效工程用菌去除难降解有毒物质方面;指出了生物修复技术具有较好的生态和经济效益,发展应用前景广阔。关键词:生物技术；诱变；原生质体融合；基因工程；工程菌种Abstract:Environmentalbiotechnologyisnewlydevelopingtechnologyinthe21stcentury.Itisgenerallyacknowledgedthatenvironmentalpollution,resourceproblem,ecologydestroy,andhealthproblemandsooncanbesolvedbyenvironmentalbiotechnology.Thecontentsandcharactersofenvironmentalbiotechnologyareanalyzed.Theapplicationofenvironmentalbiotechnologytoenvironmentalprotectionandremediationisdiscussed.Keywords:EnvironmentalBiotechnology;EnvironmentalProtection;EnvironmentRemediation环境生物技术(environmentalbiotechnology)是直接或间接利用生物的生理活动,建立降低或消除污染物的生产工艺,或能够高效地净化被污染的环境以及将污染物转化为资源的人工技术.它包括环境中污染物的减少、污染场地的生物修复和生物可降解材料的开发和应用等.其核心是微生物学过程.它是近20年来产生的一门多学科相互渗透的新兴边缘学科,主要涉及生物技术、工程学、环境学和生态学等学科.环境生物技术可以按技术难易划分为三类[1].第一类是指以分子生物学技术为主体,以基因工程为主导的污染控制与监测技术,包括构建降解杀虫剂、除草剂、多环芳烃类化合物等污染物的高效基因工程菌,创造抗污染型转基因植物等.第二类是以目前大量应用的经过改革与创新的生物处理技术,如生物流化床法、上流式厌氧甲烷发酵法和变形活性污泥法等等.第三类包括:生物稳定塘、人工湿地和污染控制资源化生态工程等自然净化系统.笔者仅讨论后两种环境生物技术.1环境生物技术的特点生物与环境之间既有对立的一面,又有统一的一面,生物体靠体内调节和变异来适应环境变化,同时通过自身来影响和改变环境.环境生物技术拥有许多其他方法不可比拟的优势,如微生物对各类污染物均有较强、较快的适应性,并可将其作为代谢底物降解和转化,具有效果好、运行费用低、无二次污染等优势.用生物方法处理污染物的最终产物大都是无毒无害、稳定的物质,如二氧化碳、水、氮气和甲烷等,通常可一步到位,避免了污染物的多次转移,因此它又是一种消除污染安全而彻底的手段.另外,生物处理技术的产物或副产品,大多可以较快生物降解的,并可作为资源加以利用,有助于把人类活动产生的环境污染减到最小程度.生物技术还易于进行大规模操作,一些生物曝气池、生物滤池的容积之大,也是其他工艺望尘莫及的.生物方法还可以就地利用天然水塘或土壤层作为污染物处理场所,这可大大降低处理费用.因此生物技术在环境领域的应用将是势不可挡的.环境生物技术具有深远的发展前景,特别是对于寻求用低成本解决环境问题的发展中国家具有极大潜力.在自然界中存在许多优良菌种能有效分解自然界中的各种物质,但随着现代工业的不断发展,人工合成的非天然物质日益增多。例如:有机氯农药、有机磷农药、塑料、合成洗涤剂等一些高浓度、高毒性的有机污染物,不易被自然界中现存的微生物降解,这些物质在土壤和水中存留时间较长,衰减75%～100%所需的时间要几年甚至几十年,其在土壤和水体中不断积累,严重污染了环境。因此,在环境工程中极其需要快速降解污染物的高效菌种,为此,研究人员已将生物技术引入到环境工程当中来。生物强化技术自20世纪70年代中期产生以来,经几十年的研究与应用,已在生物修复中显现出了强大的生命力,该方法可有效提高有毒有害污染物的去除效果,将生物强化技术融入到传统的生物修复中,并结合现代分子生物技术提供的新方法、新手段进行监测和评价,已成为生物修复发展的一种趋势.2生物育种技术2.1诱变育种2.1.1短波长射线诱变短波长射线,主要以紫外线为主。紫外线可以引起DNA的变化。DNA链上的碱基对紫外辐射很敏感。因为碱基吸收的光波波长和紫外辐射发射波长非常接近,DNA强烈吸收紫外辐射。引起DNA结构变化的形式有多方面,例如:DNA链的断裂,DNA分子内和分子间的交联,核酸与蛋白质的交联,胞嘧啶和鸟嘌呤的水和作用及胸腺嘧啶二聚体的形成等。王战勇等[2],采用可以降解PHB的青霉(Penicillumsp)DS9701菌株作为试验的出发菌株,经过紫外线的照射诱变处理,分离得到一种突变菌株DS2003。结果显示,菌株DS2003对PHB的日降解率提高了7.5%,降解等量PHB所用时间减少了3d。将诱变后的菌株DS2003连续传代5次继续测定其对PHB的降解率,结果表明,DS2003菌株连续传代5次后对PHB的降解率基本稳定。吴忆宁等[3],采用在连续流条件下以活性污泥代替纯菌种进行UV诱变,作用效果显著且具应用潜力。通过与普通驯化的污泥进行比较发现,经诱变的活性污泥更适于降解木质素,且效率较高。乔庆霞等[4],对自然筛选出的优势混合菌进行紫外诱变,在紫外线下照射40s时筛选出6种菌株,其中B04菌株对CODCr降解率较未诱变菌提高了19.71%,对TCl的降解率较未诱变菌提高了99.86%。沈齐英等[5],采用紫外诱变,处理由燕化炼油厂污水厂的活性污泥中驯化筛选得到的降酚菌株,好氧条件筛选出2种高效降酚微生物QH2和QH3。实验证明,温度对QH2、QH3生长影有非常显著的意义,P<0.01,在30℃时生长良好。应用QH2和QH3菌种处理炼油厂含酚废水,菌种能够有效地降解较为复杂的含酚污水,且QH2菌种处理效果最佳。2.1.2电离辐射射线诱变电离辐射射线,主要是χ-射线,γ-射线等。曹德菊等[6],利用60Coγ-射线辐照处理活性污泥。结果表明,辐照后的活性污泥SV30、SVI、MLSS、污泥增长率均低于对照,特别是污泥增长率,当辐照剂量为500Gy以上是呈直线下降;辐照处理活性污泥的污水COD去除率也明显降低,氨氮去除率在低剂量(50、100Gy)时分别为92%～95%和94%～97%,处理效率优于对照。2.1.3化学诱变化学诱变即采用化学物质对微生物进行诱变,引起基因突变或真核生物染色体的畸变。常用的诱变剂有:碱基类似物5-氨基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶及2-氨基嘧啶、脱氨剂羟胺(NH2OH)和亚硝胺(HNO2)。2.2原生质体融合技术育种利用原生质体融合技术育种原生质体融合衍生有如下几种技术方法：(1)利用原生质体再生时对再生条件的控制,使菌株遗传特性发生改变的原生质体再生育种方法。(2)通过加热或UV照射处理,使参与原生质体融合的一方灭活的“定向”融合技术,灭活一方在融合过程中可将其遗传物质传递给有活力的受体原生质体。WangMinqin等[7]发现在进行原生质体融合实验之前,采用不同强度、不同时间长度的紫外线对原生质体进行照射,其融合子的DNA存在着极大的区别。实验说明,紫外线对细胞原生质体的诱导作用,有利于融合子细胞中亲本优势性状的增强。(3)利用原生质体进行染色体DNA转化、质粒DNA高频转化、原生质体的转染、利用脂质体进行原生质体的转化和转染技术。(4)原生质体融合技术和电子技术相结合的电融合技术。电诱导原生质体融合技术是将两个彼此靠近的细胞在电脉冲的作用下两者发生质膜的融合,这种方法需要专门的仪器———电融合仪,方法直观、定向、高效。张甲耀等[8],已对选育蒽降解生物耦合降解菌株的电融合过程及融合子的筛选过程进行研究,并得到了最佳诱导参数。卢显妍、尹华等[9],采用对铬有较高抗性的热带假丝酵母(Candidatropicalis)和具有较高除铬性能的解脂假丝酵母(C.lipolytica)作为亲本菌体进行电场诱导融合,实验结果表明,融合子R32的去除率和还原率都明显高于2株亲本菌。当处理低浓度含铬废水时,去除率和还原率可达到100%;处理高浓度含铬废水(200mg/L)时,还原率仍可达到50%以上。王守刚等[10],采用CRY—3型细胞融合仪,在改变电场强度,其他电融合参数不变的情况下处理供试固氮菌(N5-1)和磷钾菌(N17)亲本。(5)电穿孔法(electroporation),电脉冲使电场中的细胞膜可逆地形成小孔(nm),周围溶液中的外源基因得以进入细胞,这是一种将外源性分子(基因或DNA序列),引入细胞内的方法,用以进行转染或细胞融合。(6)在溶液中加入表面活性剂,可促进电融合。ZhiyuJiang等[11],在进行原生质体电融合的实验时发现,在溶液中加入中性表面活性物质DX,TAGB,Span-80以及AEO-9可以促进原生质体的融合。同样,在低浓度带正电荷的表面活性物质Bardac2280以及两性物质CAB脂类的作用下,也可提高电融合率。相反,带负电荷的聚合体表面活性物质K12andCar2sonolTLSy等则对反应起副作用。所有这些新技术方法无疑均提高了原生质体融合的效率,扩大了原生质体融合技术的应用范围。2.3基因工程基因工程也称遗传工程、重组DNA技术,是现代生物技术的核心,是以细胞外进行DNA拼接、重组技术的基因工程,是以人们可控制的方式来分离和操作特定的基因。它能创造新的物种,能赋予微生物新的机能,使微生物生产出自身本来不能合成的物质,或者增加它原有的合成能力。凡由传统的诱变、筛选以及重组育种技术能做到的任何事情,均可用基因工程做得更好、更有效、更容易成功。基因工程是当今最重要的高新生物技术之一,在环境工程菌种选育上的成果令人振奋。例如:吴伟等[12],采用重组基因酵母(通过将雌激素受体(h2ER)的DNA整合到含lac-Z报告基因的质粒(编码β-半乳糖苷酶)上,并转至酵母细胞中所成的转基因酵母)和SOS/Umu试验分别检测了壬基酚聚氧乙烯醚(NP10EO)经生物降解前后的雌激素活性和致突变活性,在此基础上探讨了两者的相关性,为控制此类物质的环境污染效应提供了依据。李尔炀、史乐文[13],采用染色体DNA转化原生质球的方法,构建一株处理含PTA废水的工程菌LEY3。LEY3能同时降解6种化合物:PTA、萘、苯甲酸、十六烷、乙二醇和甲醇。用LEY3对含PTA生产废水作降解试验,COD的去除率在66%～91%之间。2.4各种生物手段相结合的育种方法诱变、融合以及基因工程都是菌种改良的基本手段和有效工具,其中诱变是最基础的方法,尽管融合和基因工程是菌种改良最有效、最有潜力的方法,但是与诱变的方法结合起来,就会优势互补,构建出更有效的工程菌种。例如:裘娟萍等[14],以红发夫酵母AS2.1557为出发株,经诱变育种总色素含量提高8.5倍,总色素产量提高2倍。用生长弱、含量高的突变株与生长快、含量低的野生型进行原生质体融合,融合子产量比高产亲株提高169%。廖劲松等[15],已经对降解聚乙烯醇菌株进行原生质体培养及融合的研究。他们从自然界中分离得到4株能降解聚乙烯醇(PVA)的细菌,经紫外线诱变,得到2株具有单重抗药性的突变菌株S7和K15,将其作为亲本菌株进行原生质体融合,并通过正交试验,对原生质体融合的条件进行优化,融合率达到4.603×10-5。融合子F-4菌株培养成活性污泥后,PVA去除率可达87%,是普通活性污泥的3～4倍。陈菲莉等[16],以三环芳烃蒽为模式污染物,把高效降解蒽的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)和产生物表活剂的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugiosa)作为耦合降解系统的两种构建菌,分别进行Co60辐射诱变再与根际优势菌进行原生质体电融合,融合子再定殖回土壤。通过铜绿假单胞菌产生的表面活性剂进一步提高少动鞘氨醇单胞菌降解蒽的能力,用以恢复被多环芳烃污染的环境。3问题与展望3.1问题尽管环境生物技术相对安全,但在其应用当中还存在一定的问题与困难,主要表现在以下几方面:(1)反应速度较慢,需要较大的反应器和占较大面积的土地；(2)对原水水质有严格的要求,否则会影响微生物的正常生长；(3)运行中可能会出现污泥膨胀和流失,剩余污泥也难处理；(4)对于人工合成物,特别是难生化降解的污染物,一般的微生物也是无能为力；(5)活的有害菌体可能从实验室泄露,大规模工程微生物的应用可能影响生态系统。3.2展望随着经济的腾飞、人口的膨胀、资源的短缺、环境状况的恶化以及人们环保意识的增强,生物技术的环境保护功能越来越显得重要,其明显的经济效益、环境效益和社会效益引起科技界和企业界的极大关注。生物技术在环境污染修复和防治,资源的再生利用,无公害产品的生产开发和生态环境保护等方面起到了相当重要的作用,对人类社会的可持续发展产生重要影响。因此,世界各国都极为重视,并投入大量人力、物力进行研究开发:要培养新的特效物种并进一步提高其应用效率、降低应用成本;运用各种相关技术加以优化组合,尤其是高效、低能耗、易普及的特种微生物与特殊工艺的最佳结合；加强不同专业、不同学科之问的合作,如将毒理学和微生物学和环境工程相结合；重点从根本上消除污染源,充分协调人与自然之间的关系,充分实现废物资源化。参考文献:[1]ALVESCF,MELOLF,VIEIRAMJ.Influenceofmediumcompositiononthecharacteristicsofadenitrifyingbio2filmformedbyAlcaligenesdenitrificansinafluidizedbedreactor[J].ProcessBiochemistry,2002,37(8):837-845[2]王战勇,张洪林.降解聚β-羟基丁酸菌株的诱变育种[J].抚顺石油学院学报,2001,21(4):36-38[3]吴忆宁,刘士锐.UV诱变技术培养造纸废水高效降解菌[J].中国给水排水,2003,19(11):16–18[4]乔庆霞,陈中豪.高效降解多种氯化物优势混合菌的诱变筛选研究[J].水处理技术,2003,29(3):137-140[5]沈齐英,刘录.紫外诱变选育高效降酚微生物[J].环境科学与技术,2004,27(1):82-85[6]曹德菊,庞晓坤,周诗华.60Coγ-射线诱变活性污泥辅助处理生活污水的研究[J].环境科学学报,2005,25(4):540-544[7]YUZeng-liang.IonBeanandLifeScience-ANewResearchField[J].Physics,1997,6(2):333-338[8]王海,张甲耀.离子注入在生物强化技术中的应用研究[J].环境科学与技术,2005,28(1):6-8[9]NAOTOU,RIEKOH,HIROYUKIH.Effectofmitochondriaonelectrofusionofyeastprotoplasts.Enzyme&MicrobTechn2ol,1998,23(1-2):107-112[10]RENJP,DICKSONMH,EARLEED.ImprovedresistancetobacterialsoftrotbyprotoplastfusionbetweenBra