羊传染性脓疱皮炎病毒的研究进展

羊传染性脓疱皮炎病毒的研究进展

绵羊感染性脓皮炎通常被称为“羊口伤口”。它是由羊感染性脓皮炎（或fv）引起的绵羊、山羊和人类的急性、接触性和嗜皮性传染病引起的。它以羊、山羊和其他动物的嘴唇、鼻孔周围的皮肤、口腔粘膜和乳房为特征。它主要是由于皮肤和粘膜的增生性疾病（德尔菲等人，2003；张家新等人，2006）。本病常呈群发性流行,以3~6月龄的羔羊最易感,成年羊发病较少。虽然本病为温和性疾病,但口、唇等部位病变严重时,将严重影响羔羊吃奶、采食、吞咽,导致衰弱死亡,有报道患病羔羊的病死率可高达93%(Mazur等,1989)。目前,该病在欧洲、美洲、非洲等一些主要养羊国家广为分布,严重威胁世界养羊业的发展和人类的健康。1orfv基因组ORFV基因组庞大,为线性双股DNA,分子量约为88.8×106Dα。ORFV基因组长约130~150kb,然而不同毒株长度有10~25kb的差异。Robinson等(1982)用限制性酶切片段多态性分析(RFLP)方法对11株新西兰分离株分析的结果表明,基因全长约为140kb;Gassmann等(1985)的研究结果表明,10株欧洲分离株基因全长约为138.2~141.2kb。多数学者认为ORFV包括130个基因,其中127个为线性基因,ORFV基因组包括位于两末端的反向末端重复序列(ITR)和中间的一个大的编码区(Cottone等,1998,Mercer等,1987),与痘病毒科其他成员相似。病毒基因组的两端由ITR形成闭合环状发夹结构,并且ITR中存在0.5~1kb的变异片段。临近发夹结构处,有一段小于100bp的高度保守序列,其序列是决定DNA复制所必需的。中间区域基因相对保守(Robinson等,1987)。一般认为ORFV基因组的两端包括一些与病毒的毒力、宿主范围、免疫逃避及免疫调节有关的基因,具有病毒种属特异性(Delhon等,2004)。基因组内部结构(即保守区DNA序列)包括一些与病毒在细胞中复制和病毒粒子在细胞浆中装配成熟有关的基因。2dutpase的基因组织基因序列编码ORFV是动物病毒中体积最大、结构最复杂的病毒,其编码产生的蛋白多达几十种。ORFV编码的功能蛋白主要有:dUTPase、42kD蛋白、IFNR、DNA聚合酶、RNA螺旋酶、病毒粒子蛋白、RAP94、后期基因转录蛋白、拓扑异构酶、后期基因反式作用子、核心蛋白、RNA聚合酶、10kD蛋白、GM-CSF抑制因子(GIF)、IL-10和VEGF等。目前国内外研究的热点是与其结构组成、致病性、免疫调节相关的一些蛋白。如10kD融合蛋白等对病毒结构的形成具有重要作用。dUTPase、IFNR、IL-10、GM-CSF抑制剂(GIF)和VEGF等一些蛋白通过结合一些免疫调节因子并降低其活性,导致机体的免疫反应降低,从而对宿主产生致病性。42kD蛋白、37kD蛋白等具有良好的免疫原性,能刺激机体产生强烈的抗体反应。2.110kD蛋白Spehner等(2004)通过构建缺失编码10kD蛋白的基因的ORFV突变体对其超微结构进行了研究,研究结果发现,ORFV突变体仍能在其易感细胞上增殖并包装成具有侵染性的病毒粒子,然而其表面缺乏ORFV特有的螺旋型微管结构,仅存在短且排列紊乱的微管。这表明ORFV编码产生的10kD蛋白对其表面特征性微管结构的形成起到非常重要的作用。2.2dUTPasedUTPase由ORFV中长约474bp的基因序列编码产生,该蛋白以原核融合形式表达。Cottone等(2002)首次对ORFV编码的dUTPase的功能活性进行研究,体外试验结果表明,该酶的活性范围较广(pH6.0~9.0的条件下均能发挥活性),且能与dUTP特异性地结合,其中在pH7.0,Mg2+存在的情况下,该酶的活性最强。之后研究结果发现,缺失编码dUTPase基因的甲型疱疹病毒突变体的致病力减弱,这暗示该蛋白酶对病毒毒力有决定作用;又有研究结果发现,自然缺失编码dUTPase的基因的ORFV突变体在细胞内的增殖并未受到影响,但对细胞的致病性减弱,这进一步证实了上述结论。因此,编码dUTPase的基因是一个毒力基因,对于缺失编码dUTPase的基因或dUTPase活性低的病毒株,其对机体的致病性降低,很可能是由于该基因的缺失导致病毒复制过程中出现缺陷。2.3IFNRIFNR是由ORFV中长501bp的基因序列编码产生,该蛋白又称干扰素抗性蛋白,是一种双链RNA结合蛋白,它能与IL-10一起产生,从而抑制干扰素的抗病毒效应(Haig等,1998)。2.4IL-10ORFVIL-10是由ORFV基因组中长约558bp的基因序列编码产生,其分子量大小约为22kD。限制性酶切片段多态性分析(RFLP)和Southern印迹的分析结果表明,不同毒株编码IL-10的基因片段长度相同且位于ORFV基因组中的同一位置,仅个别核苷酸存在差异。编码ORFVIL-10的基因序列的上游序列和下游序列高度保守,它们是痘病毒所特有的早期转录调节序列。不同毒株的类早期启动子序列相同,它是由位于启动子上游62nt处一个富含A+T的TAATAATGAACTATAA构成,同时一个早期转录终止序列TTTTTAT被发现位于终止子下游101nt处(Moss,1994)。IL-10是一种重要的免疫调节因子,它具有抑制炎症反应、降低抗原递呈作用和抑制T淋巴细胞活化等多种功能(Griitz,2005)。这些暗示ORFV编码产生的IL-10能够破坏感染动物机体的先天性免疫反应和特异性的细胞免疫反应。2.5GM-CSF抑制因子(GIF)GIF是一种特异性的双重细胞因子结合蛋白,由定位于ORFV基因组右末端的一段基因序列编码产生(Deane等,2000),这段序列很可能是病毒宿主在相互适应过程中由于基因发生重组而获得。此外,研究结果发现,仅副痘病毒属成员具有编码GIF的基因序列,因此依据该基因序列建立起的PCR诊断方法用于该属成员的鉴定较为敏感和特异(Haig等,2002a)。ORFVGIF是ORFV编码产生的细胞因子结合蛋白中第一个被报道的,它能够与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2(IL-2)结合并且抑制二者的活性(Scet等,2003),这暗示着GM-CSF和IL-2在机体抗病毒感染过程中发挥着重要作用。GIF分子包含一个WDPWV基序,该基序能与Ⅰ型细胞因子受体超家族中的WSXWS基序结合,这对其生物学活性的发挥非常必要。此外,GIF蛋白的糖基化位点对其与GM-CSF的结合非常关键(McInnes等,2005)。2.6VEGFORFVVEGF是由与病毒基因组右末端的反向重复序列相邻的一段基因序列编码产生的一种多肽,这种多肽与哺乳动物的血管内皮生长因子(VEGFs)有一定的同源性(Ferrara等,1991)。然而,不同病毒株编码的VEGF的氨基酸序列之间的差异较大。对不同毒株编码产生的VEGF的功能分析结果表明,不同毒株编码产生的VEGFs在生物学活性和与受体结合特异性上也存有差异,因此有人推测不同毒株编码产生的VEGFs在ORFV感染过程中起到不同的作用。然而,最近一项研究结果表明,虽然编码VEGF的基因序列及其在体外的生物学活性有显著差异,但该病毒编码产生的VEGF作为一种毒力因子,对自然宿主产生的致病性上功能相似,能引起相同的病理变化(包括血管化反应、水肿、表皮角质化和结痂等)。缺失编码VEGF基因的重组病毒感染后引起的血管化程度明显降低,并且在一定程度上减缓病毒的增殖。ORFV感染引起的以血管内皮强烈增生和血管高度扩张为特征的传染性脓疱皮炎与其编码产生的VEGF有关,目前这一结论已得到证实(Wise等,2007)。2.742kD蛋白42kD蛋白是由位于ORFV基因组左末端的BamHⅠ/B片段上的B2L基因编码产生,该蛋白与痘苗病毒的氨基酸同源性达42%。B2L基因长1137bp,是一重要的保护性抗原基因。B2L基因在病毒DNA开始复制后即活跃地开始翻译。42kD蛋白是病毒囊膜的主要成分之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应(Sullivan等,1994)。虽然ORFV以细胞免疫为主,但该蛋白良好的免疫原性仍引起国内外学者的高度重视,一些研究者用B2L基因与病毒囊膜亚单位中的其它保护性抗原基因进行重组,以望获得能对机体产生有效保护的基因工程苗。国内王廷璞等(2006)通过将编码42kD蛋白的B2L基因与pGEM-4Z载体进行重组,已筛选出具有较高表达水平且能传代的重组菌。2.839kD蛋白39kD蛋白是由ORFV基因组上的F1L基因编码产生的,F1L基因长为1005bp,是一个完整的开放阅读框。Czerny等(1997)用ORFV的单克隆抗体、竞争ELISA、免疫荧光和Westernblotting等多种方法对病毒囊膜上的多种蛋白进行了研究,分析结果表明,ORFV的单克隆抗体都能与病毒表面特异性的抗原决定簇结合,39kD和22kD两种蛋白是ORFV单克隆抗体的主要结合位点。其中39kD抗原多肽被认为是病毒表面微管的组成成分之一,并且这种多肽很可能与诱导宿主产生中和抗体有关。3orfv感染后机体的免疫指标检测ORFV具有高度的嗜上皮性,目前多数学者认为ORFV主要引起局部强烈的免疫反应,且以细胞免疫为主;体液免疫水平较为低下,且血液中产生的抗体消失很快,用常规的血凝、补反等试验方法均无法检测(Torfason等,2002)。由于该病毒在免疫学上的特殊性,国内外学者用ELISA、Westernblotting和琼脂扩散及多种免疫学方法对ORFV感染后机体的一些免疫学指标进行检测,然而报道结果不尽相同。Trueblood等和Jan等用常规的免疫试验方法没有检测到抗体的存在。Azwai等(1995)用ELISA和Westernblotting方法从被感染骆驼血清中检测出特异性IgG和IgM的存在。Mckeever等认为动物在首次接种后只能产生少量抗体,但这些抗体具有记忆功能,当再次接受抗原刺激时,抗体滴度将会急剧上升,在接种后第5周达到高峰。Hussain等认为ORFV中和抗体在机体感染后24d内消失,中和抗体消失后即使给羊注射1×109PFU的病毒液也不发病。对感染ORFV12d的羊的淋巴液进行检测,发现T淋巴细胞明显增多,因此,他认为羊感染ORFV后介导的主要是细胞免疫。4orfv在免疫调节和肝胰腺组织中的调节作用ORFV在首次感染痊愈后能使宿主发生再感染,它很可能是通过病毒编码的一些毒力因子的作用使机体的免疫力降低。对ORFV致病机制的研究近年来取得了较大的进展,Delhon等认为ORFV编码产生的IFNR、IL-10、CBP、GIF和VEGF等一些对宿主有致病性的毒力因子和有免疫调节作用的细胞因子在ORFV致病机制中发挥重要作用,它们主要通过干扰和或破坏宿主的免疫反应使机体的免疫力下降,从而引起宿主发病。McInnes等(2005)研究结果发现,IL-10和一种双链RNA结合蛋白(IFNR)一起具有抑制干扰素的作用。Fleming等(Bruce等,2003)证实ORFV编码产生的趋化因子结合蛋白(CBP)与C-和CC-趋化因子有高度的亲和性,它能与趋化因子表面的受体结合位点上的氨基酸残基结合。CBP与炎症反应相关的CC-趋化因子(MCP-1、MIP-1α和RANTES)等结合后,能抑制单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞向感染部位聚集。此外,还能与C-趋化因子中的淋巴细胞趋化因子(能表达淋巴细胞趋化因子受体XCR1的T细胞、嗜中性粒细胞和B细胞)相结合发挥作用。研究结果发现,ORFVCBP还能聚集一些对Th1细胞具有调节作用的蛋白质选择性地抑制Th1细胞介导的炎症反应。Mercer等(Savory等,2000)证实在病毒感染早期,被大量转录生成的VEGF是一种重要的毒力因子,它主要引起血管的高度扩张和表皮的强烈增生。因此,对这些毒力因子的研究将为宿主如何对抗病毒感染提供新思路。5采用实时pcr方法检测orfvORFV的检测可根据典型的临床症状、流行情况作出初步诊断,然而由于ORFV与其他一些病原(如口蹄疫病毒、羊痘病毒和蓝舌病病毒)感染后的临床症状非常相似,尤其是细菌继发感染或混合感染时将增加临床诊断工作的难度。因此确诊需要通过电镜负染、血清学方法、动物接种等方法进行进一步的实验室检验。研究证实了这些方法的可行性,然而ORFV在免疫上的特殊性使得对其检测还没有完整的和特异性的方法。Becher等(2002)、Yasuo等(2002)、Einar等(2002)采用PCR方法检测ORFV,结果表明该方法的灵敏性和特异性均较高。Nitsche等(2006)首次建立了用于副痘病毒检测的实时PCR检测方法,用该方法对临床上分离的41株病毒株进行检测的结果表明,其灵敏性和特异性均较高,与其他病毒不存在交叉反应性,最低能检出4.7个拷贝数的病毒粒子。目前,建立一种有效、快速的分子生物学检测方法成为该病的研究热点之一。羊传染性脓疱皮炎目前尚无有效的治疗药物,疾病处于自限性时,通常使用抗生素阻止细菌继发感染;处于并发症时,常使用局部冷敷疗法或切除法;疾病较为严重时,可进行必要的切除(Degraere等,1994)。对该病进行免疫预防时常使用灭活苗和弱毒苗,它们虽然能在一定程度上降低感染的严重性,但是并不能完全阻止疾病的发生。ORFV在免疫上的特殊性使得还没有有效的疫苗用于该病的免疫预防。目前世界各国正加紧进行病毒基因工程苗的研究工作(Anderson等,2001;Mazur等,2