参芪扶正注射液治疗癌因性疲乏的实验研究

参芪扶正注射液治疗癌因性疲乏的实验研究

癌症是人类健康和死亡的主要疾病。癌因性疲乏（cancer-relatedfatigue,CRF）是癌症患者最常见的主观症状之一，可由癌症引起，或是癌症治疗的结果。癌症患者的疲乏发生率为34%～76%，接受化疗的患者有75%～96%会产生疲乏，且持续时间长，极大地影响患者的生活质量，成为治疗和康复的重要影响因素。因此，探索癌因性疲乏的病理生理机制以制定出行而有效的预防和治疗的策略是非常有必要的。目前提出的疲乏病因机制假说包括：5-羟色胺（5-HT）失调，迷走传入神经的激活，肌肉的改变和血浆皮质醇代谢异常，下丘脑-垂体-肾上腺轴功能异常和24h节律异常以及促细胞素失调。人体的内分泌系统包括内分泌腺及某些脏器中内分泌组织所形成的一个体液调节系统，调节人体的代谢过程、脏器功能、生长发育、生殖衰老等生命现象，维持体内环境的相对稳定，以适应体内、外的变化，许多疾病通过神经体液代谢紊乱也可影响内分泌系统的功能和结构，引起内分泌系统的紊乱。内分泌系统的调节主要是通过下丘脑前部视上核和脑室旁核的神经纤维下达垂体后叶，将分泌的激素沿神经纤维输送到后叶储存，再通过周围靶腺而影响全身。下丘脑-垂体-肾上腺轴就是一个典型的内分泌系统，它作用的最终靶腺就是肾上腺皮质，而由肾上腺皮质束状带所合成和分泌的皮质醇就反映了肾上腺皮质的功能状态，同时也反映了下丘脑-垂体-肾上腺轴的生理活动情况。如果皮质醇缺乏，可引起多系统的症状，包括：1）胃肠道系统：食欲减退、嗜咸食，体重减轻，恶心呕吐，胃酸过少，消化不良，腹泻，腹胀，腹痛，常加重消瘦虚弱。2）神经系统：乏力，淡漠，疲劳，嗜睡，迷糊，精神失常。3）心血管系统：血压降低，心脏缩小，心音低钝。患者常有头昏、眼花、直立性昏厥。4）肾脏：排泄水负荷的能力减弱，在大量饮水后可出现稀释性低钠血症。糖皮质激素缺乏及血容量不足。5）代谢障碍：糖异生作用减弱，肝糖原耗损，可发生空腹低血糖。储存脂肪消耗，脂质的动员和利用皆减弱，导致消瘦。6）免疫系统：对各种急慢性应激的抵抗能力下降。而这些表现在癌症患者表现的尤为突出，可说明肾上腺皮质的功能变化在癌因性疲乏的发病过程中可能具有重要的作用，本文将就此做进一步的验证。1材料和方法1.1癌症动物模型的建立1.1.1模型分组把裸鼠（BALB/C裸鼠130只，雌雄兼用，重量26～28g,6w龄，由中国药品生物制品检定所实验动物资源中心提供[实验动物合格证号SCXK（京）2005-0004）]随机分为：正常对照组（10只）；模型对照组（30只）：其中轻度疲乏组、中度疲乏组、重度疲乏组各10只；治疗组（90只）：其中轻度疲乏组、中度疲乏组、重度疲乏组各30只，每组再分3个治疗小组分别是参芪扶正注射液注射组、5-氟尿嘧啶注射组、参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组，每组各10只。1.1.2生存状况的观察1）将冻存于液氮中人胃癌BGC-823细胞株（由河北医科大学第四医院肿瘤研究所提供）取出，解冻培养，使用细胞计数板计数，按照2.5×106/mL细胞浓度，0.2mL/只注射到裸鼠。2）裸鼠饲养于室温22±2℃、正常光照的SPF级动物室中5只/笼，按照50mg/kg的剂量以氯胺酮行腹腔注射麻醉裸鼠，常规消毒皮肤，沿左侧正中旁线切开，刀口约1.0cm，小心暴露腹膜与胃壁，用一次性注射器将肿瘤细胞注射于胃壁浆膜层，缝合腹壁及皮肤。3）以钴60灭菌饲料喂养，每日观察裸鼠的饮水量、进食量、体重、皮毛色泽、日常活动、粪便及体重情况。在出现活动减少、皮色变暗、体重减轻、饮水进食量减少时，开始行为学方面的测定以了解疲乏程度。4）学习记忆情况的观测：(1)水迷宫实验（中国医学科学院药物研究所研制）：此实验可作为脑力疲乏的评定标准之一，可根据出离迷宫时间的不同来判定疲乏的程度（轻度疲乏约为89.69±26.38s，中度疲乏约为113.62±33.72s，重度疲乏约为136.44±41.56s）。(2)旷场实验（开阔法）：此实验可作为脑力疲乏的评定标准之一（观察裸鼠在开阔箱正中格内的活动情况，包括在正中格停留时间、方格间穿行次数即三爪以上跨入临格的次数、竖起时间即两前肢离地1cm以上的时间）。(3)鼠尾悬挂实验：此实验可作为体力疲乏的评定标准之一（观察裸鼠在倒挂状态下6min内的不动时间）。(4)力竭游泳实验：此实验可作为体力疲乏的评定标准之一（记录裸鼠从入水到头部沉入水中10s不能浮出水面的时间）。依据此4个试验将疲乏程度分为轻度、中度和重度疲乏。1.2药物分组的选择在判定裸鼠出现疲乏及评定分级后，对治疗组裸鼠进行药物经鼠尾静脉注射，依注射药物的不同分为参芪扶正注射液（丽珠集团利民制药厂生产，250mL/支，含党参、黄芪、氯化钠等国药准字Z19990065）注射组、5-氟尿嘧啶（天津金耀氨基酸有限公司生产，0.25g/10mL/支国药准字H12020959）注射组、参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组，此分组相当于培本扶正治疗组、化疗组、培本扶正联合化疗组。各组注射剂量为参芪扶正注射液4g/kg（相当于2mL/kg）（此剂量与临床常用剂量250mL/D/人是相当的），5-氟尿嘧啶25mg/kg（相当于1mL/㎏），均连续注射5天，而后进行血浆皮质醇（标准品为Sigma公司产品）含量检测和肾上腺皮质束状带超微结构的电镜观察。1.3肾上腺素超微结构的制作摘除裸鼠眼球，由眼后静脉取血后处死裸鼠，在放有冰块的搪瓷盘中迅速剪开腹部皮肤，找到肾上腺并分离取出，按电镜标本制作要求制作（详见肾上腺超微结构观察）。血液予以低速离心（4000rpm,10min），取上清液以1:1滴入乙腈，充分混匀，在4℃离心机离心（12000rpm/min,5min），取上清液备用。1.4检测波长的确定高效液相色谱（配SPD-10Avp紫外检测器、7725i定量进样器装置及C18色谱柱LC-10ATvp日本岛津公司）配合样品衍生化后用荧光检测器分析波长，流动相为甲醇∶水=7∶3(V∶V），波长240nm，进液量为10μL，用外标法定量。1.5肾上腺皮质带的超微结构观察取材、固定、脱水、包埋、切片染色后进行透射电镜（日本电子JEM-1230）观察、拍片、记录。1.6统计方法统计软件采用SAS6.0分析，实验结果均以x±s表示，组间差异采用方差分析，用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组裸鼠血浆皮质醇的比较各疲乏状态治疗组裸鼠的血浆血浆皮质醇含量均低于正常对照组（表1）。轻度疲乏组中各治疗组裸鼠的血浆皮质醇含量均低于正常对照组。其中参芪扶正注射液注射组与5-氟尿嘧啶注射组比较、正常对照组与5-氟尿嘧啶注射组比较均为P<0.01，有显著性差异。其余各组间比较均为P<0.05，有显著性差异。中度疲乏组中各治疗组裸鼠的血浆皮质醇含量均低于正常对照组。其中3个药物治疗组与正常对照组比较、以及参芪扶正液注射组与5-氟尿嘧啶注射组比较均为P<0.01，有显著性差异。其余各组间比较均为P<0.05，有显著性差异。重度疲乏组各中治疗组裸鼠的血浆皮质醇含量均低于正常对照组。其中3个药物治疗组与正常对照组比较、以及参芪扶正液注射组与5-氟尿嘧啶注射组比较均为P<0.01，有明显差异。其余各组间比较均为P<0.05，有显著性差异。各级疲乏组中的模型对照组与正常对照组比较P<0.01，有显著性差异。2.2肾皮质束状带结构正常对照组可见肾上腺皮质束状带细胞核呈圆形，线粒体嵴呈管状，可见无界膜脂滴，滑面内质网呈空泡状（图1）。轻度疲乏组中应用参芪扶正注射液注射组可见肾上腺皮质束状带细胞核圆形，胞浆内含有脂滴部分有水肿现象或空泡化，线粒体嵴呈管状，滑面内质网较少。参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组可见细胞核圆形，线粒体嵴呈管状且小部分消失，脂滴减少，滑面内质网数量减少。模型对照组可见线粒体小部分外膜消失，嵴呈管状部分稀疏，脂滴和滑面内质网数量进一步减少。5-氟尿嘧啶注射组变化最明显，可见肾上腺皮质束状带细胞核边缘不规整，线粒体嵴稀疏部分消失，嵴排列不规则，脂滴深染色（图2）。中度疲乏组中应用参芪扶正注射液注射组可见肾上腺皮质束状带细胞核圆形，胞浆内脂滴减少，线粒体嵴呈管状稍肿胀，滑面内质网较少。参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组可见细胞核圆形，线粒体嵴呈管状小部分消失成空泡状，未见明显脂滴，滑面内质网数量减少。模型对照组可见线粒体小部分外膜消失，嵴呈管状部分稀疏，胞浆水肿，脂滴和滑面内质网数量进一步减少，且外膜不完整。5-氟尿嘧啶注射组变化最明显，可见肾上腺皮质束状带细胞核边缘不规整，线粒体嵴稀疏部分消失，嵴排列不规则，脂滴深染色，体积增大（图3）。重度疲乏组中应用参芪扶正注射液注射组可见肾上腺皮质束状带细胞核圆形，胞浆水肿未见脂滴，线粒体嵴呈管状稍肿胀，滑面内质网较少。参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组可见细胞核圆形，胞浆水肿未见脂滴，线粒体嵴呈管状小部分消失成空泡状。模型对照组可见肾上腺皮质束状带细胞核边缘不规整，线粒体小部分外膜消失，嵴呈管状部分稀疏，脂滴和滑面内质网数量进一步减少，且外膜不完整，脂滴密度不均匀。5-氟尿嘧啶注射组变化最明显，可见肾上腺皮质束状带细胞核边缘不规整，线粒体嵴稀疏大部分消失，嵴排列不规则，脂滴深染色，大小不一，部分体积增大（图4）。3肾组织中功能状态的变化疲乏是临床慢性病中常见的症状，癌因性疲乏更是癌症患者在诊疗过程中的主要特征。目前认为癌因性疲乏的出现与癌症的治疗及体内内分泌系统的代谢改变有一定关系，这可能是癌瘤的刺激造成下丘脑-垂体-肾上腺轴产生应激反应所致，而且肾上腺皮质是腺垂体的靶器官，因此本实验针对裸鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的终末环节—肾上腺皮质束状带进行观察以及束状带分泌的皮质醇进行测定，以此来了解肾上腺皮质的功能状态，进而反应下丘脑-垂体-肾上腺轴的情况。国外对疲乏的认识至今只有一百多年的历史，不少专家认为“疲乏是代谢产物的积累，活动所需基质的耗损，基质生理生化状态变化和调节机能失调”等，而祖国医学对疲乏的认识已有五千多年的历史，《黄帝内经》指出“有所劳倦、行气衰少、古气不盛、上焦不行、下胱不通、而胃气热、劳则喘、汗出、内外皆越，故气耗尔”阐明了疲乏或劳倦等易耗损精气，导致阴虚的发病机制。肾在中医被看作是“先天之本”，有藏精、主水、主命门之火、主骨、生髓、通脑等功能。《杂病广要·虚劳篇》指出“凡虚损之由，无非劳倦七情饮食所致，或先伤其气，气伤必及精”。许多研究也证明补肾对于消除疲劳是有效的。传统中医描述的“肾”并不仅是现代医学中的肾脏，它不但与泌尿系统有关，而且与生殖、部分内分泌和中枢神经系统功能有关。近十余年来大量研究证明，中医的肾与下丘脑-垂体-靶腺轴功能的关系尤为密切。Fulder等报道肾上腺切除大鼠应用补肾益气药物治疗后与生理盐水对照组相比，大脑某些区域皮质醇结合显著增加，由此可见补肾益气中药在治疗疲乏中是有一定的理论依据的。肾上腺皮质在应激过程中起着较为重要的作用，尤其是在皮质束状带所分泌的糖皮质激素—皮质醇，对机体的营养物质代谢起着非常重要的作用。一般而言，在束状带内线粒体、滑面内质网与脂滴是参与糖皮质激素（皮质醇）合成的主要细胞器，因此它们的体积、数量、和形态的变化在一定程度上就反映了肾上腺皮质的功能状态。有报道，在长期应激因素的刺激后，肾上腺皮质细胞增大，细胞核的体积缩小，甚至核仁核膜消失，脂滴的数量减少和体积水肿增大。在本实验中，模型组裸鼠经造模后出现不同程度的疲乏表现为力竭游泳时间降低，鼠尾悬挂实验挣扎时间缩短，水迷宫实验出离时间延长，旷场实验穿行次数减少、两前肢竖起次数及时间减少，且随着疲乏程度的加重这些实验的疲乏表现也加重，这些实验充分说明受试裸鼠在躯体和精神上的疲乏状态已产生。此时肾上腺皮质在电镜下的超微结构显示随着疲乏程度的加重，肾上腺皮质束状带内脂滴逐渐水肿空泡化，线粒体管状嵴逐步出现水肿、空化现象及断裂或缺失现象，细胞核外膜逐渐变得不规整。这些现象的出现说明肾上腺皮质功能随着疲乏的加重而逐步走向衰竭。针对各治疗组的受试裸鼠，应用参芪扶正注射液治疗后的裸鼠的肾上腺皮质束状带中线粒体管状嵴有少量水肿和空化现象，有滑面内质网、脂滴的数量稍减少；而5-氟尿嘧啶和参芪扶正注射液联合注射组裸鼠的肾上腺皮质束状带中线粒体管状嵴有进一步水肿和空化现象，滑面内质网、脂滴的数量进一步减少；模型对照组的肾上腺皮质束状带中线粒体数量减少，管状嵴有较重的水肿和空化现象，滑面内质网、脂滴的数量明显减少；单用5-氟尿嘧啶的裸鼠细胞核模不规整，线粒体数量进一步减少，管状嵴有严重的水肿和空化现象，滑面内质网、脂滴的数量在各组中最少。同样，血浆皮质醇含量在正常对照组、轻度、中度、重度疲乏组呈递减趋势；在参芪扶正液注射组、参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组、模型对照组和5-氟尿嘧啶注射组也呈递减趋势（各治疗组间两两比较有统计学差异P<0.01或P<0.05）。这都说