抗原刺激诱导的cd4

抗原刺激诱导的cd4

c4-t淋巴结是一个调节体液和细胞导管免疫功能的细胞。CD4+T细胞通过其膜表面的抗原受体识别由抗原提呈细胞提供的特异性抗原的刺激信号(第一信号),同时在辅助分子信号(第二信号)的作用下,CD4+T细胞开始活化、分裂并主要分化成Th1和/或Th2细胞。CD4+T细胞的分化受许多因素的影响,其中最重要的因素就是细胞因子。IL-12诱导Th1细胞的分化,而IL-4诱导Th2细胞的分化。Th1细胞释放IFN-γ和LTα,参与细胞介导的免疫反应,而Th2细胞释放IL-4、IL-5和IL-10,参与体液介导的免疫反应。为此,与静止型CD4+T细胞相比,活化后的CD4+T细胞不但在膜分子表现型上,而且细胞内基因和细胞因子的产生以及生物功能都发生了明显改变。为了进一步探讨抗原特异性CD4+T细胞的分裂与细胞膜表型和效应功能之间的关系,本研究观察TCR-TgCD4+T细胞,经特异性抗原刺激后,检测细胞的分裂与CD25、CD44、CD62L和CD69分子的表达以及细胞内细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10产生之间的关系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验大鼠转基因小鼠(DO11、10,TCR-Tg)购自Taconic(U.S.A),均为雌性,6~8周龄。1.1.2耐药抗体和适用基因Per-CP标记的抗CD4、APC标记抗IFN-γ(APC-IFN-γ)、APC-抗IL-2、APC-抗IL-4、APC-抗IL-10、APC-抗CD25、APC-抗CD44、APC-抗CD62L、APC-抗CD69和APC标记的匹配对照抗体均购自美国BD/PharMingen(Becton.Dickinson/PharMingen)公司。PE标记KJ1-26单克隆抗体购自CaltagLaboratories(Burlingame,CA)。白细胞介素(IL)-12购自BD/PharMingen。1.2方法1.2.1cd4+t细胞的分离取小鼠脾和淋巴结,研磨、纱网过滤,然后经Ficoll密度梯度离心(2000r/min,20分钟),收取单个核淋巴细胞。抗原提呈细胞(APC)的制备:取正常BALB/C小鼠脾细胞与抗小鼠CD4+、CD8+T细胞和抗Thy1抗体和补体孵育,去除T细胞,洗涤2次(1800r/min,10分钟)后,细胞悬浮于RPMI1640(含10%胎牛血清)培养液中。经γ射线照射(3000rad)后,洗涤细胞2次,吸弃上清,RPMI1640重悬,计数细胞,作为抗原提呈细胞。CD4+T细胞的分离:取OVAT细胞受体转基因小鼠的单个细胞悬液(TCR-Tg),用PBS+BSA+EDTA缓冲液洗涤2次(1800r/min,10分钟),按Miltenyi公司说明书叙述的方法加入抗CD4+T细胞磁珠,分离CD4+T细胞。经由抗TCR-Tg特异性抗体(KJ1-26)染色,流式细胞仪分析证明>99%的CD4+T细胞TCR-Tg阳性。1.2.2细胞/ml测定磁珠分离的CD4+-TCR-Tg细胞悬浮于磷酸盐缓冲溶液中,细胞浓度为10×106细胞/ml。CFSE(购自MolecularProbes公司,Eugene,OR)加入细胞悬液中,其终浓度为0.25μmol/L,细胞与CFSE于室温孵育7分钟,然后用PBS洗涤3次,并悬浮于RPMI1640培养液中。1.2.3th1细胞分化CFSE标记的TCR-TgCD4+T细胞和抗原提呈细胞按1∶6细胞比例置于6孔培养板中,同时加入1μg/ml的OVA多肽抗原(OVA323-339)作为刺激组,不加OVA孔为对照组,而加入OVA抗原同时加入2ng/ml的IL-12为Th1细胞分化组。孵育3天后,收集细胞,进行细胞表面染色。细胞内细胞因子产生的检测,简言之,收集的细胞计数后,再与抗原提呈细胞1∶6混合,加入OVA多肽刺激5小时,刺激的第一个小时后,加入Brefeld-A(BFA)(购自Sigma)10μg/ml以阻止胞内高尔基体介导的细胞因子转运。1.2.4洗消液反应细胞表面染色按照常规染色方法进行操作。简言之,细胞悬液100μl,加入标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体,4℃下避光反应30分钟,洗涤2次(1800r/min,8分钟)。细胞内细胞因子的染色,将待测细胞用PBS洗涤2次后,加入细胞固定液,室温固定7分钟,洗涤2次,然后加入200μl含有通透剂(Sapomin,Sigma)的牛乳缓冲液作用过夜,加入特异性的胞内标记单抗,4℃避光反应30分钟,洗涤2次,300μl染色缓冲液重悬细胞,流式细胞仪分析实验结果。1.2.5tcr-tg抑制剂的检测应用流式细胞仪FACSCalibur进行检测。以CD4和TCR-Tg抗原表面标志(KJ1-26)双标记细胞群开窗(gating),以相同种IgG染色为阴性对照。Cellquest收集细胞(总数50000个细胞),并分析流式结果。2结果2.1ova多肽刺激cfse-标记的tcr-tgcd4+t细胞的分离众所周知,CD4+T细胞经抗原刺激后,开始活化和分裂,在IL-12的作用下,分化为Th1细胞。为了进一步阐明细胞分裂的次数和是否IL-12促进细胞的分裂,我们利用OVA抗原多肽刺激CFSE-标记的抗原特异性的TCR-TgCD4+T细胞,在抗原提呈细胞存在的情况下,3天后检测细胞的分裂。从图1可以看出,当缺乏OVA多肽时,CD4+T细胞没有任何分裂,可见只有一个细胞峰。当OVA多肽刺激3天后,大多数CD4+T细胞分裂1~5次,而且分裂2~3次的细胞占大多数。当IL-12加入OVA多肽刺激的细胞后,IL-12促进可细胞的分裂,可见3~4次分裂的细胞占大多数。2.2cd65p分子的表达为了探讨细胞的分裂和细胞表面活化分子和粘附分子之间的关系,我们检测抗原特异性CD4+T细胞在抗原刺激前后细胞膜表面标记的变化。从图2可以看出,随着细胞的分裂,细胞膜表面分子的表达有3种类型的变化:①CD25和CD44分子在未活化CD4+T细胞的表达很低,当受到抗原的刺激后,在细胞分裂之前,CD25和CD44分子的表达明显增加,随着细胞分裂次数的增加,CD25和CD44分子也随着增加。②CD62L分子高表达于未经抗原刺激的CD4+T细胞,随着细胞分裂次数的增加,CD62L的表达逐渐下降。③同样地,CD69不表达于未经抗原刺激的细胞,经抗原刺激后,CD69在没有分裂的细胞(分裂0细胞)上的表达没有明显的增加,但当细胞分裂1次后,几乎所有的细胞均表达CD69,随着细胞分裂次数的增加,CD69分子的表达随之下降。IL-12对这些膜分子的表达未见有明显影响。2.3抗原刺激对il-2表达的影响为了进一步探讨细胞分裂与细胞因子产生之间的关系,CFSE-标记的TCR-TgCD4+T细胞,在抗原提呈细胞存在的情况下,利用OVA多肽刺激TCR-TgCD4+T细胞。3天后,收集细胞,在抗原提呈细胞存在的情况下,再一次利用OVA多肽刺激TCR-TgCD4+T细胞,同时加入BFA阻止胞内细胞因子释放,5小时后收集细胞、固定、破膜后,进行细胞内细胞因子染色。结果如图3所示,在初次培养时未经抗原刺激的细胞,细胞没有分裂,这些细胞经抗原刺激5小时后,可见37%的细胞产生IL-2,0.2%的细胞产生IFN-γ,1%左右的细胞产生IL-4和0.6%左右的细胞产生IL-10。在初次培养后,再一次抗原刺激时,IL-2阳性的细胞减少。随着细胞分裂次数的增加,IFN-γ、IL-4和IL-10产生的细胞逐渐增加。IL-12增加IFN-γ产生的阳性细胞,促进分裂3~4次细胞产生IFN-γ,抑制IL-4和IL-10产生细胞,但对细胞的分裂次数未见有明显影响。3胞内分裂和细胞细胞因子的表达免疫细胞的活化和增殖是免疫反应成功的一种标记。CD4+T细胞对抗原和致有丝分裂原刺激的反应性,表现在细胞膜表面活化分子和粘附分子的表达、细胞的分裂和细胞因子的产生。最适应的免疫反应条件除了需要高浓度的抗原通过T细胞抗原受体传递激活的信息(第1信号)外,还需要由抗原提呈细胞通过共刺激分子所提供的第2信号,这些多种信号的共同作用促使T细胞的分裂。经过分裂后,最终分化成为效应T细胞,产生效应细胞因子如IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2)。目前许多研究均集中于观察T细胞的功能和表现型之间的相关性,但有关同时检测细胞内的分裂次数与细胞表面活化标志和细胞内细胞因子的表达的报道甚少。为此,我们探讨了当抗原特异性CD4+T细胞经抗原刺激后,细胞的分裂与细胞表面型和细胞因子产生之间的关系。我们的结果提示,当细胞受到刺激后某些细胞表面分子表达的高低和细胞因子产生的多少与细胞分裂有着一定的关系。从图2可以看出,当CD4+T细胞受到抗原刺激后,在细胞分裂之前CD25的表达增加,当细胞第一次分裂以后,CD25的表达达到高峰,并维持在较高水平。而CD69分子是在细胞第一次分裂时表达最高,随着细胞分裂次数的增加其表达逐渐减少。这些结果进一步证实了CD25和CD69分子均是CD4+T细胞活化的标志,但是我们的结果提示,与CD25分子相比,CD69的表达与细胞分裂与否有着更加密切的关系。细胞粘附分子CD44和CD62L的表达也与细胞的分裂有着密切的关系,CD44分子随着细胞的分裂而增加,但是CD62L随着细胞的分裂而减少。为此,观察CD44和CD62L的表达的分子密度来判别初始T细胞和效应T细胞。这些分子的改变也提示初始T细胞和效应T细胞在组织器官分布的差异。此外,我们还利用细胞内细胞因子的检测作为CD4+T细胞效应功能的标志,在单个细胞水平上我们证实IL-2与细胞的活化有关,而IFN-γ、IL-4和IL-10与细胞的分裂有关,随着细胞分裂次