番茄红素提取工艺的优化

番茄红素提取工艺的优化

番茄是一种由多聚烯环链组成的九种胡萝卜。它具有和平的开环结构，包括11个普通键和2个非公共键。这是未通过最后一种无香环碳氢化合物。在自然界中,番茄红素主要以全反式结构存在(图1),从有机溶剂中析出的番茄红素纯品为针状深红色晶体。在成熟的番茄果实中,番茄红素含量(以100g果实计)可达1～14mg;在高含量的纤维素番茄果皮中为42.3mg,番茄籽中为4.0mg。在类胡萝卜素中,番茄红素的抗氧化性能最强,并具有诱导细胞连接、抑制肿瘤细胞增殖、活化免疫等功能。因此番茄红素逐渐成为功能性食品组成和抗癌(如前列腺癌、消化道癌和膀胱癌等)研究中的热点。番茄红素不溶于水,难溶于乙醇和甲醇,可溶于氯仿和苯等有机溶剂。尽管卤代烷烃是比较理想的溶剂,但因安全性问题而不适用于食品中番茄红素的制备。笔者将新鲜番茄去籽,取其果皮,打浆粉碎作为原材料,进行番茄红素的萃取纯化。探索在一定预处理条件下,有机溶剂及混合溶液、温度、时间和固液比等对番茄红素萃取效果的影响,确定以新鲜番茄为原料,提取番茄红素的最佳萃取工艺条件,为工业化提取提供实验依据。1番茄浆的制备参考文献和文献的方法,选用乙醇对番茄浆进行洗涤处理。将番茄红素萃取液在502nm处测定吸光度,比较不同萃取条件下番茄红素的萃取效果。1.1试剂和机器1.1.1实验原材料市售新鲜成熟番茄。1.1.2主要试剂及仪器石油醚、丙酮、乙酸乙酯和乙醇(96%)均为分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司;纤维素酶(比酶活为400U/mg)和果胶酶(比酶活为500U/mg),上海楷洋生物技术有限公司;番茄红素纯品,上海西宝生物科技有限公司(美国原装进口LKT品牌)。1.1.3仪器、仪器和仪器匀浆机,上海普瑞塞斯仪器有限公司;离心机、恒温温浴锅,江苏金坛荣华仪器公司;分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;高效液相色谱仪,中国科学院上海生化细胞研究所。1.1.4高效液铬hplc的实验条件ODSC18分离柱;流速1.0mL/min;流动相为V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1的混合溶液;柱温30℃;检测波长472nm。1.2生长聚合酶ld50-固液萃取-萃取将新鲜番茄去籽打浆粉碎,等分成5份,各试样编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。Ⅰ号:不调pH,不加酶;Ⅱ号:将pH调为8,不加酶;Ⅲ号:不调pH,加0.07%(质量分数,下同)纤维素酶和0.04%果胶酶;Ⅳ号:将pH调为8,加0.07%纤维素酶和0.04%果胶酶。然后将上述试样Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ同时置于一个55℃水浴中温浴2.5h,期间不断搅拌。将反应完的试样于8000r/min离心10min,弃上层水相。试样Ⅴ不加酶、不调pH、未经温浴,直接离心后弃上层水相。各试样分别用乙醇洗涤沉淀,再离心弃上层乙醇,得较为干燥的番茄渣。按1∶4的固液比(g/mL),在锥形瓶中用V(石油醚)∶V(丙酮)为1∶2的混合溶液于50℃萃取25min。所得的萃取液分别在502nm处测定吸光度。空白对照用V(石油醚):V(丙酮)为1∶2的混合溶液。1.3体积比对测定选用石油醚和丙酮混合溶剂(体积比分别为1∶1、1∶2和1∶4);丙酮和乙酸乙酯混合溶剂(体积比分别为1∶1、1∶2和1∶4);石油醚和乙酸乙酯混合溶剂(体积比分别为1∶1、1∶2和1∶4)为萃取剂。固液比(g/mL)为1∶4,于50℃温浴萃取25min。所得的萃取液分别于502nm处测定吸光度。空白对照用相应有机溶剂的混合溶液。1.4萃取时间的影响以V(石油醚):V(丙酮)为1∶2的混合溶液为萃取剂,固液比(g/mL)为1∶4,分别于25、35、45、50、55℃萃取25min。在502nm处分别测定不同温度下所得萃取液的吸光度。空白对照为V(石油醚):V(丙酮)为1∶2的混合溶液。1.5萃取剂为固液比的测定以试样I为萃取原料,选用V(石油醚):V(丙酮)为1∶2的混合溶液为萃取剂,以1∶4的固液比(g/mL)在锥形瓶中50℃萃取,不断轻微摇晃。在502nm处分别测定5、10、15、25、35、45min的吸光度。空白对照用V(石油醚):V(丙酮)为1∶2的混合溶液。1.6固液萃取条件选用V(石油醚):V(丙酮)为1∶2的混合溶剂,分别以1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8的固液比(g/mL),在锥形瓶中50℃萃取25min。所得的萃取液分别在502nm处测吸光度。空白对照用V(石油醚):V(丙酮)为1∶2的混合溶液。2结果与讨论2.1番茄红素的提取不同预处理方法对番茄红素的提取影响明显不同,结果如图2和图3所示。由图2和图3可知:试样Ⅲ的吸光度最高,为1.350,说明酶可以有效地提高番茄红素的萃取率。试样I的萃取效果次之,吸光度略低(1.314),但比不做任何处理的试样Ⅴ的吸光度(1.282)高。在番茄果皮组织细胞中,番茄红素以多种形式存在。在果皮细胞中,番茄红素存在于质体中,并被质体膜包围。除对萃取有利的结晶态外,相当数量的番茄红素与其他组分以复合体的形式镶嵌在生物膜上。在工业化大生产中大量提取番茄红素,必须打破这些屏障。可能是由于试样I在55℃温浴时,果皮中的酶分解掉了一部分的纤维素和果胶,极大地增加了质体与溶剂的接触面积,打破了提取番茄红素的屏障,促进了溶剂的渗透,使萃取率比不做处理的试样Ⅴ的萃取率高。当有纤维素酶和果胶酶的加入时(试样III),纤维素和果胶的分解则更为充分,所得的萃取效果更好。在实际生产时,使用纤维素酶和果胶酶会大量增加成本。因此提取番茄红素的最佳预处理条件为55℃、温浴2.5h。试样II、IV的效果低于I、III的原因可能是pH为8时,部分酶失活导致无法分解番茄中的果胶和纤维素。2.2萃取溶剂为混合溶剂不同萃取溶剂和萃取效果如图3所示。由图3可知:单溶剂萃取时,选用乙酸乙酯比石油醚、丙酮的效果好,吸光度达1.194;石油醚的萃取效果最差,吸光度仅为0.900。选用混合溶剂为萃取剂时,提取率比单溶剂好。其中,石油醚和丙酮为混合溶剂可大大提高番茄红素的萃取率,两者体积比为1∶2时,萃取液吸光度达1.378,明显高于其他溶剂;且萃取残渣颜色很淡,萃取液上层的油脂红色最深,-20℃过夜后,发现有番茄红素晶体析出。以石油醚和丙酮为混合溶剂萃取,发现体积比为1∶1时,油相的量多于体积比为1∶2时的萃取量。为了进一步比较哪种比例的萃取液效果好,分别取上层油相,稀释到相同体积再测定吸光度,结果发现V(石油醚)∶V(丙酮)为1∶1的吸光度为1.270,V(石油醚)∶V(丙酮)为1∶2的吸光度为1.308。故选择石油醚和丙酮体积比1∶2的混合溶剂为萃取番茄红素的最佳萃取溶剂。2.3萃取温度对番茄红素萃取的影响萃取液在不同温度下的吸光度见图4。由图4可知:随着温度的不断升高,吸光度也随之增加,即在一定的温度范围内,番茄红素的萃取率随温度的升高而增加。当温度达55℃时,接近了萃取溶剂的沸点(丙酮沸点为56.48℃),溶剂大量挥发,影响了萃取效果,导致实验失败。所以应该在溶剂的沸点下,尽量选择较高的萃取温度,以提高番茄红素的提取效果。故确定50℃为最佳萃取温度。2.4不断萃取的番茄红素稳定性萃取时间对萃取效果的影响如图5所示。由图5可知:在25min之前,吸光度随时间的延长而增加。说明随着时间的推移,不断有番茄红素从试样中被萃取出来;而25min后吸光度趋向于平缓,几乎不再增加,说明此时番茄渣中的番茄红素基本被萃取完全,达到稳定值,再延长时间对提高萃取效果影响不大。故确定25min为最佳萃取时间。2.5固液比对番茄红素萃取效果的影响当固液比为1∶2、1∶3(g/mL)时,试管内有深红色的番茄红素晶体析出,说明此时固液比已经很高,溶剂量相对偏少,番茄红素过饱和,导致番茄渣中番茄红素萃取不充分而浪费原材料。故1∶2、1∶3不是适合的固液比。为了方便分光光度计的测定,进行1倍稀释后测定吸光度,空白对照均为相应有机溶剂的混合溶液。由图6可知:吸光度随着固液比的减少而减少,即萃取液中番茄红素的含量随固液比的降低而减少。为了减少有机萃取剂的使用量,提高原料的利用率,用最少的原材料提取更多的番茄红素,又不使番茄红素从有机溶剂里析出,综合考虑后确定1∶4为最佳固液比。2.6hplc测定按照上文所述的最佳实验条件,即55℃温浴2.5h,固液比为1∶4(g/mL)在封口的锥形瓶中,用体积比为1∶2的石油醚与丙酮的混合溶剂为萃取剂,50℃萃取25min后,从新鲜番茄中萃取番茄红素,用此法所得试样进行HPLC测定。HPLC测定结果与番茄红素标准品的HPLC结果进行比较,结果如图7和图8所示。由番茄红素标准品HPLC图谱(图7)可知:番茄红素出峰时间为33min左右。由图7和图8可知:最佳萃取条件下所得萃取液在33.248min有明显出峰,与番茄红素标准品的相符,说明萃取液内含有大量的番茄红素,而其他时间段杂峰较少。证明所萃取的番茄红素纯度较高。3番茄渣的提取通过对预处理条件、萃取溶剂、时间、温度和固液比等影响番茄红素提取效果的因素进行研究和综合比较。设计出番茄红素的最佳提取方法:将新鲜番茄去籽打浆粉碎,55℃温浴2.5